Неалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) – це клінічно важливе захворювання, що виникає у людей із ожирінням або інсулінорезистентністю. Методи ранньої діагностики та оцінки НАЖХП, шляхом кількісного виміру стеатоза, необхідні для більш раннього втручання, і для запобігання прогресування цирозу.
Hidekatsu Kuroda, Keisuke Kakisaka, Naohisa Kamiyama, Takayoshi Oikawa,
Mio Onodera, Kei Sawara, Kanta Oikawa, Ryujin Endo, Yasuhiro Takikawa, Kazuyuki Suzuki
Резюме
Мета. Протестувати на дефіцитних по лептину мишах з ожирінням (ob/ob) і різними ступенями стеатозу печінки новий діагностичний метод, використовуючи акустичний кількісний аналіз структури (ASQ) і асоційований з ним аналітичний параметр «співвідношення фокального спотворення» (FD-ratio, focal disturbance ratio).
Методи. Дев’ять мишей з ожирінням (ob/ob) на 5, 8 і 12 тижнях життя (n = 3 у кожній віковій групі) використовували для моделювання стеатозу печінки. Ехо-сигнали отримані при УЗД аналізували за допомогою ASQ, який проводить статистичний аналіз ехо-амплітуд для оцінки негомогенності в досліджуваній ділянці. Предметом даної роботи було обчислення FD-ratio. FD-ratio, ділянки жирових включень і їх розміри порівнювали між групами.
Результати. У дослідних групах не спостерігалося фіброзу та запалення. Ділянки жирових включень значно (P <0.01) збільшувалися з віком: 1,25% ± 0,28% у 5 тижнів, 31,07% ± 0,48% у 8 тижнів, 51,69% ± 3,19% у 12 тижнів. Середнє значення розміру жирових включень також значно (P<0.01) збільшувалися з віком: 1,33 (0,55-10,52) мкм у 5 тижнів, 2,82 (0,61-44,13) мкм у 8 тижнів і 6,34 (0,66-81,83) мкм у 12 тижнів. Середньостатистичне значення FD-ratio складало 0,42 ± 0,11 у 5 тижнів, 0,11 ± 0,05 у 8 тижнів і 0,03 ± 0,02 у 12 тижнів. Спостерігалася значна негативна кореляція між FD-ratio і площею жирового включення (r = -0.7211, P= 0.0017) або його розміром (r = -0.9811, P = 0.0052).
Висновок. Цей інструмент для статистичного аналізу сигналів при УЗД, що використовує FD-ratio, можна застосовувати для точного визначення кількості жиру in vivo в тваринної моделі стеатозу печінки. Він може служити, як кількісний біомаркер стеатозу печінки.
ВСТУП
Неалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) – це клінічно важливе захворювання, що виникає у людей із ожирінням або інсулінорезистентністю, і часто супроводжується метаболічним синдромом, який включає діабет, гіперліпідемію і/або гіпертензію. Неалкогольний стеатогепатит (НАСГ) – найважча форма НАЖХП, вважається основною причиною цирозу печінки невідомого походження. Методи ранньої діагностики та оцінки НАЖХП, шляхом кількісного виміру стеатоза, необхідні для більш раннього втручання, і для запобігання прогресування цирозу.
Золотим стандартом для кількісної оцінки стеатоза вважається гістологічний аналіз печінки (біопсія). Однак, біопсія печінки має різні недоліки, такі як потенційні помилки при заборі біоптатів, труднощі повторної процедури через етичні проблеми та ускладнення (кровотеча). Тому, необхідно розробляти альтернативні неінвазивні методи діагностики.
Нещодавно для кількісного аналізу стеатоза стали широко використовувати кілька неінвазивних методів, таких як УЗД, комп’ютерна томографія (КТ) та магнітно-резонансна томографія (МРТ). Однак, повторне обстеження пацієнтів з НАЖХП проводити важко тому, що при КТ пацієнт отримує дозу опромінення, а МРТ дорого коштує. Виходячи з цього, УЗД є відмінним методом діагностики, оскільки володіє мінімальною інвазивністю, недорого коштує, а повторне його використання не шкодить здоров’ю пацієнта. Більше того, УЗД високочутливе до визначення жирових накопичень в печінці. Однак, діагностична спроможність УЗД залежить від умінь оператора, а якісні методи діагностики ліпогенезу в печінці ще не відкриті.
За останні роки, Yamaguchi et al. повідомили, що дифузні патологічні зміни в тканині печінки можна якісно оцінити на підставі статистичного відхилення ультразвукових сигналів, в порівнянні зі здоровою печінкою. В основному, ультрасонографічні зображення паренхіматозних органів, таких як печінка мають картину «спекл-структури» (speckle pattern), яка складається з безлічі маленьких ехо цяточок. Спекл картина утворюється ультразвуковою інтерференцією розсіяних ультразвукових хвиль, які викликані незліченною кількістю об’єктів, що їх відображають. Аналіз зображень спекл картин можна застосовувати для ідентифікації характеристик тканини печінки при хронічних захворюваннях тому, що картина змінюється, залежно від структурних характеристик середовища. Один з таких методів – функція ймовірності щільності (probability density function – PDF) ехо-амплітуд спекл картини, яка, як описано в літературі, апроксимується функцією розподілу Релея (Rayleigh distribution). Toyoda et al. запропонували акустичний кількісний аналіз структури (ASQ), і повідомили про можливість квантифікації дифузних захворювань печінки або моніторингу регресії/прогресування фіброзу під час лікування. Однак, ще не публікували робіт, в яких описана можливість оцінки стеатозу печінки у пацієнтів з НАЖХП з використанням цього інструменту для статистичного аналізу ультразвукових сигналів.
Метою даної роботи є підтвердження можливості методу кількісної візуалізації, який застосовується для визначення та вимірювання стеатоза зі статистичною інформацією від ехо-сигналів із «співвідношенням фокального спотворення» (FD-ratio). Як справжню модель НАЖХП ми використали дефіцитних по лептину мишей з ожирінням (ob/ob).
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Це дослідження – спільна праця Медичного Університету Івате і Toshiba Medical Systems. Але, прямої фінансової підтримки від Toshiba Medical Systems не було.
Тварини
Протоколи досліджень на тваринах були схвалені центром досліджень на тваринах нашої установи. Дев’ять самців мишей (ob/ob) п’яти тижневого віку (на початку дослідження) були куплені в Charles River Laboratories (Yokohama, Japan). Під час експерименту їх тримали на звичайній дієті. Мишей поділили на три групи (n = 3 у кожній), і кожна з них пройшла експеримент, описаний нижче, на 5, 8 і 12 тижнях життя, відповідно.
У загальний наркоз мишей вводили шляхом внутріпарієтального введення 40-50 мг/кг пентобарбіталу натрію (Ovation Pharmaceutical, Deerfield, IL). Далі, провели інтраопераційне УЗД, а пізніше видалення печінки для гістологічного дослідження.
Ультразвукове дослідження
Для ультразвукового дослідження в цій роботі використовували УЗ апарат Aplio XG (Toshiba Medical Systems, Otawara, Japan) разом із лінійним датчиком 12 МГц (PLT-1204BT). Режим сканування – В-режим (T: 6.0 / R: 12.0 МГц). Глибина і фокус зображення були постійними: 15 мм і 7,5 мм. Поперечні зрізи паренхіми печінки фіксувалися в цифровому вигляді з сирими даними (rawdata), які складалися з лінійних амплітуд без косметичної обробки зображень. Сирі дані завантажили на комп’ютер в DICOM форматі. FD-ratio вираховували за допомогою програмного забезпечення ASQ (детально розписане в наступному розділі). Досліджувану ділянку (ДД) встановили на одній глибині – 2,5 мм від поверхні печінки (Рис. 1). FD-ratio вимірювали 10 раз поспіль, а середньостатистичне число (після виключення чисел, що різко відхилені) використовували, як кінцевий результат. Паралельно, середньостатистичне число інтенсивності ехо паренхіми печінки вимірювалося програмним забезпеченням Image-J (NIH, USA).
Аналітичний метод
Принципи методу ASQ полягають в наступному. Коли ехо-сигнали генеруються від маленьких щільних відбиваючих часточок, які знаходяться за межами просторової роздільної здатності, ультразвукове зображення будується з інтерференції звукових хвиль (спекл шум). В такому випадку, PDF ехо-амплітуд можна приблизно обчислити за розподілом Релея. У нормальній паренхімі печінки, такі статистичні результати не можна описати розподілом Релея тому, що є наявність таких структур, як судинні стінки. Результати ще більше віддаляються від розподілу Релея при наявності вузлів, фіброзу, цирозу. Ми висунули гіпотезу, що при прогресивному збільшенні жирових включень, ці розкиди будуть генерувати інтерференцію хвиль або будуть маскувати оригінальні маленькі структури, що наблизить PDF до розподілу Релея.
Рис. 1. ASQ. При параметричній візуалізації, інтенсивність розподілу можна відображати на розділеному екрані колірним кодуванням. Велика досліджувана ділянка перебувала на фіксованій глибині 2,5 мм від поверхні печінки.
Як тільки оператор вибирає всеосяжну ДД (далі велика-ДД) на зображенні, кілька сотень маленьких ДД (далі маленькі-ДД) автоматично виставляються для того, щоб обчислити PDF (Рис. 2А). Необхідний параметр Сm2 в аналізі позначається цим рівнянням:
де μ і δ2 – середньостатистичне число і дисперсія ехо-амплітуд в маленькій-ДД, відповідно. δ2R(µ) є варіантом, коли розподіл Релея обчислюється від середньостатистичного числа. Результати для маленьких-ДД у великій-ДД виведені на гістограмі входження С2 (матеріальна вісь Рис. 2В). Якщо зразки складаються з спекл шуму, С2 гістограма сходиться до 100 з вузькою дисперсією, а структурна інформація зробить середньостатистичне число більшим, а дисперсію ширшою.
FD-ratio обчислюється таким чином. Спочатку, Сm2 позначається як:
де δm дисперсія, обчислена з зразків менших µ+4δ. Якщо співвідношення С2/Сm2 більше, ніж граничне значення α, результат Сm2 виключається з гістограми (матеріальна вісь), але додається до альтернативної гістограми (пунктирна лінія). FD-ratio – це співвідношення площі обмеженої кривою (AUC) для цих двох гістограм:
RFD =[AUC (real)]/[AUC (dotted)]
Рис. 2. Схематичне зображення досліджуваних ділянок використаних для статистичного аналізу радіочастотного сигналу за допомогою акустичного кількісного методу, та Сm2-гістограма.
А: встановлена велика-ДД насправді складається з декількох сотень маленьких-ДД, які використовуються для обчислення безлічі Сm2 (інтенсивність або амплітуда) значень; В: результати показані як входження на Сm2 гістограмі.
Тут, граничне значення α було 1,2, тому RFD= 0 коли зразки показували розподіл Релея для PDF, і має позитивне значення при наявності найменших структурних змін. Програмне забезпечення ASQ також має функцію візуалізації, яка реконструює двомірне кольорове зображення С2, виміряне для кожної позиції (параметричне зображення).
Гістопатологічні аналіз
Гістопатологічне дослідження проводив досвідчений патолог, сертифікований Японським Співтовариством Патології. Знімки з біопсії печінки записували в JPEG формат. Використовуючи Image-J software, відсоток жирових включень обчислювали за співвідношенням між загальною площею жирової тканини і загальною площею зразка, а середньостатистичне число позначало площу жирових включень. Знову, використовуючи Image-J software вимірювали максимальний діаметр жирових включень у 8 і 12 тижневих мишей, середні числа використовували для позначення розміру включень. Таким чином, отримані площу та розмір жирових включень, порівнювали з FD-ratio.
Статистичний аналіз
Значення виведені, як середньостатистичне число ± стандартне відхилення, або медіана з розподілу значень. Для статистичного аналізу використовували Stat View software (version 5.0 $ SAS Institute, Cary, NC, USA). Тест рангової кореляції Спірмена використовували для оцінки кореляцій між двома змінними величинами, зі значною кореляцією Р < 0.05, і коефіцієнтом кореляції r ≥ 0.40. Критерій Тукі-Крамера використовували для багаторазових порівняльних тестів, і значення Р <0.05 вважалися показником значної різниці.
Рис. 3. Гістологічні зразки, знімки акустичним кількісним методом у В-режимі для кожної групи. У всіх досліджуваних групах відсутній фіброз і запальний процес. Великі жирові включення в основному спостерігалися в 12 тижневих мишей. На параметричній візуалізації, червоний і зелений кольори спостерігали разом у мишей 5 тижневого віку. Далі, до 12 тижнів, кількість червоного кольору зменшилась, а зелений став домінувати.
РЕЗУЛЬТАТИ
Порівняння гістологічних даних та ехогенності печінки
У всіх досліджуваних групах не спостерігалося фіброзу і запального процесу. В основному, великі жирові включення спостерігалися у 12 тижневих мишей (Рис. 3). Ділянки жирових включень значно (P <0.01) збільшувалися з віком: 1,25% ± 0,28% у 5 тижнів, 31,07% ± 0,48% у 8 тижнів, 51,69% ± 3,19% у 12 тижнів. Серединне значення розміру жирового включення також значно (P <0.01) збільшувалася з віком: 1,33 (0,55-10,52) мкм у 5 тижнів, 2,82 (0,61-44,13) мкм у 8 тижнів і 6,34 (0,66-81,83) мкм у 12 тижнів. Середньостатистичне значення сірих пікселів складало 65,31 ± 22,52 у 5 тижнів, 65,95 ± 19,41 у 8 тижнів і 91,32 ± 21,83 у 12 тижнів (Рис. 5). Не спостерігалося значної різниці між групами 5 та 8 тижнів, але середньостатистичне значення сірих пікселів значно зросло в 12 тижневій групі, із збільшенням яскравості паренхіми печінки.
Рис. 4. Порівняння розмірів жирових включень. Серединне значення розмірів жирових включень значно збільшувалася (bP <0.01) з віком: 1,33 мкм (діапазон: 0,55-10,52 мкм) на 5 тижні, 2,82 мкм (діапазон: 0,61-44,13 мкм) на 8 тижні і 6,34 мкм (діапазон: 0,66-81,83 мкм) на 12 тижні.
Рис. 5. Порівняння ехогенності печінки. Середньостатистичне значення сірого в кожній групі становило 65,31 ± 22,52 у 5 тижнів, 65,95 ± 19,41 у 8 тижнів і 91,32 ± 21,83 у 12 тижнів. Не спостерігалося значної різниці між групами 5 та 8 тижнів, але середньостатистичне значення сірих пікселів значно зросло в 12 тижневій групі, із збільшенням яскравості паренхіми печінки. bP <0.01 NS: не значне.
Взаємовідношення FD-ratio і площі/розміру жирових включень.
Середньостатистичне число FD-ratio складало 0,42 ± 0,11 у 5 тижнів, 0,11 ± 0,05 у 8 тижнів і 0,03 ± 0,02 у 12 тижнів. FD-ratio було значно нижчим на 12 тижні, порівняно з 5 або 8 тижнем (P <0.01 для кожної). В параметричній візуалізації червоний і зелений кольори були в приблизно рівній кількості в 5 тижнів, а в 12 тижнів став домінувати зелений колір (Рис. 3). Значна негативна кореляція спостерігалася між FD-ratio і площею жирового включення (r = -0.7211, P = 0.0017) (Рис. 6А) або розміром жирового включення (r = -0.9811, P = 0.0052) (Рис. 6В).
ОБГОВОРЕННЯ
Результати дослідження продемонстрували близьку кореляцію між FD‑ratio і ступенем жирового накопичення в печінці (гістологічна оцінка). Ці дані показують, що ASQ аналіз УЗД печінки і його параметр FD-ratio, може виступати, як новий надійний клінічний метод для оцінки стеатозу печінки.
Що стосується УЗД жирових хвороб печінки, Joseph et al. підтримують яскраву картину печінки і пропонують квантифікувати гепатоспленічний або гепаторенальний контраст.
Рис. 6. Взаємовідношення між «співвідношенням фокального спотворення» і площею/розміром жирового включення. А: значні негативні кореляції спостерігалися між співвідношенням фокального спотворення (FD-ratio) і площею жирового включення (r = -0.7211, P = 0.0017), або (В) розміром жирового включення (r = -0.9811, P = 0.0052).
Не дивлячись на те, що яскрава картина печінки і гепаторенальний контраст широко визнані, як чутливі, достовірні методи для визначення жирової хвороби печінки, не існує кількісного методу для оцінки ступеня жирового накопичення в печінці. Можуть відбуватися труднощі в УЗ діагностиці тому, що у графічній інформації, отриманій шляхом звичайного УЗД, не вистачає об’єктивної або кількісної природи, на відміну від поглинання рентгенівських променів при КТ. ASQ аналіз здатний давати об’єктивну інформацію і кількісну оцінку гістології печінки по відношенню до накопичення жирової тканини. Беручи до уваги неінвазивність і невелику вартість УЗД, ASQ аналіз може стати основним методом для діагностики жирової хвороби печінки, оцінки її ступеня і призначення курсу лікування. На додаток, ці дослідження характеристик тканин за допомогою ASQ аналізу, можуть далі розвивати методи кількісної діагностики інших дифузних захворювань печінки, включаючи фіброз або запальний процес, таким чином, зменшуючи потребу в біопсії.
Що стосується методу ASQ, існує ряд процедур, які проводять аналіз радіочастотних сигналів великої кількості маленьких-ДД у великій-ДД, з метою поліпшення аналітичної точності. Ми припустили, що в маленьких-ДД з високим ступенем спотворення від розподілу Релея, сили сигналів були б негомогенними. Ми також припустили, що існує два види негомогенних зразків: дифузна негомогенність і фокальна негомогенність. Виходячи з цього, і фокусуючи нашу увагу на маленьких-ДД з високим ступенем спотворення від розподілу Релея, як результат фокальної негомогенності структури, ми встановили FD-ratio як параметр.
З іншого боку, при стеатозі печінки спостерігається яскрава картина і васкулярна розмитість, через відображення і розсіювання ультразвукових хвиль, а також фізичного тиску на дрібні кровоносні судини набряклими гепатоцитами (викликано жировими включеннями). Ми прогнозуємо, що через щільне розміщення жирових включень (таким чином вони обгортають такі структури як дрібні кровоносні судини і жовчні протоки), яскравість паренхіми печінки збільшується, а венозні стінки печінки стають розмитими, що, в свою чергу, призводить до гомогенізації сили сигналу в кожній маленькій-ДД і до зменшення кількості фокально негомогенних маленьких-ДД. Тому, на нашу думку, якщо площа і діаметр жирових включень збільшуються, FD-ratio зменшується. Цікаво зауважити, що не було значної різниці в яскравості паренхіми печінки між 5 і 8 тижневими мишами, а FD-ratio було найнижче у 8 тижневих мишей. Виходячи з цього, можна зробити висновок, що статистичний аналіз ультразвукових сигналів може виявити, найменші зміни спекл картини, викликані стеатозом.
На закінчення, новий інструмент для статистичного аналізу ультразвукових сигналів, використовуючи FD-ratio як параметр, може бути корисним для кількісної оцінки стеатозу печінки. Отже, FD-ratio можна застосовувати, як неінвазивний біологічний маркер для раннього виявлення і кількісної оцінки стеатозу печінки.
УЗД апарат Toshiba Aplio XG ― універсальний багатофункціональний комплекс експертного класу по спеціальній ціні від компанії RH.
14.10.2019
Лина Павловна