Прогнозування ранньої та пізньої прееклампсії на доклінічній стадії за допомогою плацентарно-специфічного профілювання позаклітинної мікроРНК

Резюме

Прееклампсія (ПЕ) – одне з тяжких ускладнень вагітності, що зустрічається у 3-8% випадків і є однією з провідних причин материнської та перинатальної смертності. Фундаментальна роль у патогенезі ПЕ відводиться материнським та/або плацентарним факторам, поєднання та прояв яких визначає час появи клінічних симптомів ПЕ (до або після 34 тижнів гестації) та їх вираженість. Відомо, що рівень експресії МікроРНК – регуляторів сигнальних каскадів у клітині – залежить від терміну вагітності. У даному дослідженні ми зосередилися на ідентифікації плацентоспецифічних МікроРНК, які диференціюють ранню та пізню прееклампсію (рПЕ та пПЕ) протягом вагітності, з першого по третій триместр. Всього було проаналізовано 67 пацієнток за допомогою глибокого секвенування малих РНК та кількісної ПЛР у реальному часі, що дозволило отримати основний перелік МікроРНК (let-7b-5p, let-7d-3p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-22-5p, miR-451a, miR-1246, miR-30e-5p, miR-20a-5p, miR-1307-3p і miR-320e), які в певних комбінаціях можуть прогнозувати рПЕ або пПЕ зі 100% чутливістю і 84-100% специфічністю в 1 триместрі вагітності. За даними літератури, ці МікроРНК-предиктори ПЕ контролюють проліферацію трофобласта, інвазію, міграцію, синцитіалізацію, розгорнуту білкову відповідь ендоплазматичного ретикулума, імунну толерантність, ангіогенез та цілісність судин. Одночасне виявлення let-7d-3p, miR-451a та miR-1307-3p, стійких до багаторазового заморожування/відтавання зразків сироватки крові, у поєднанні з біохімічними (b-ХГЛ та Протеїн-А плазми, асоційований з вагітністю PAPP-A) та ультразвуковими (ІПМА) показниками дозволило розробити універсальну модель для прогнозування виникнення рПЕ та пПЕ (ХПР = 15. 7% і ХНР = 9,5%), яка була валідизована на тестовій когорті з 48 пацієнтів і продемонструвала хибнопозитивні результати в 26,7% випадків і хибнонегативні в 5,6% випадків. Для порівняння, використання загальноприйнятої програми Astraia в аналізі тестової когорти пацієнтів призвело до гірших результатів: ХПР = 62,1% і ХНР = 33,3%.

Ключові слова:  рання прееклампсія; пізня прееклампсія; мікроРНК; глибоке секвенування малих РНК; кількісна ПЛР у реальному часі; плацента; сироватка крові; перший триместр

1. Вступ

Прееклампсія (ПЕ) є мультисистемним ускладненням 3-8% усіх вагітностей [1], на яке припадає 16-18% материнських і 40% фетальних та неонатальних смертей [2]. За визначенням Міжнародного товариства з вивчення гіпертензії у вагітних (ISSHP), ПЕ визначається як гіпертензія de novo (артеріальний тиск вище 140/90 мм рт.ст.) після 20 тижнів вагітності, що супроводжується протеїнурією (не менше 0,3 г/л на добу) або ознаками гострої ниркової недостатності, порушенням функції печінки, неврологічними розладами, гемолізом, тромбоцитопенією або внутрішньоутробною затримкою росту. ПЕ може бути ранньою (рПЕ) або пізньою (пПЕ), залежно від часу появи клінічних симптомів (до або після 34-го тижня вагітності відповідно) [3]. Крім того, рПЕ характеризується більш тяжким перебігом і становить 5-20% від усіх видів ПЕ. Несприятливі наслідки для плода пов’язані з хронічною гіпоксією та високою частотою затримки розвитку, а також викликають ускладнення у плода внаслідок недоношеності, включаючи респіраторний дистрес-синдром, інфекційні та запальні захворювання, внутрішньошлуночкові крововиливи, церебральний параліч, когнітивну затримку, аутизм, психомоторні та поведінкові розлади та/або порушення здатності до навчання [4,5].

Материнські та/або плацентарні фактори відіграють фундаментальну роль у патогенезі ПЕ, що визначає час початку клінічних проявів та їх тяжкість. Порушення проліферації та диференціювання клітин трофобласта на преімплантаційному етапі в разі порушеннь в ембріональному періоді, а також на наступних етапах імплантації внаслідок запальних змін у децидуальній оболонці можуть впливати на взаємодію клітин трофобласта та ендометрія і подальший плацентогенез [6,7,8]. Порушення диференціювання клітин позаворсинчастого трофобласту призводить до недостатнього ремоделювання спіральних маткових артерій: спочатку це відбувається в децидуальному сегменті до 10-го тижня вагітності у вигляді зниження артеріальної обструкції через ендоваскулярні клітини трофобласту і, як наслідок, пошкодження ворсин плаценти активними формами кисню та азоту [9], а потім – в сегментах міометрію з 16-го по 18-й тиждень вагітності [10]. Результатом аномальної перебудови маткових артерій є підвищення їх опору та механічне пошкодження ворсин плаценти через підвищення кров’яного тиску, що потрапляє в міжворсинчастий простір [11,12,13,14]. Виникає порушення матково-плацентарного кровотоку, що призводить до гіпоксичних/ішемічних змін у тканині плаценти [1,15]. З ішемізованої плаценти вивільняються різні біологічні фактори, що спричиняють системне пошкодження ендотелію судин і виникнення гострої поліорганної недостатності у матері. Зниження концентрації циркулюючих плацентарних факторів, таких як асоційований з вагітністю плазмовий білок А (PAPP-A) і плацентарний фактор росту (PlGF), а також збільшення утворення розчинної fms-подібної тирозинкінази-1, рівні судинного ендотеліального фактора росту А (VEGF-A), інгібіну А, актину А, прокоагулянта Р-селектину, прозапального інтерлейкіну 2 та фактора некрозу пухлин альфа, асоціюються з ПЕ [1,16,17,18]. Материнські патогенетичні фактори включають генетичну схильність, імунологічні фактори, метаболічний синдром і цукровий діабет; хронічна артеріальна гіпертензія може посилити сприйнятливість матері до факторів, що виділяються ішемізованою плацентарною тканиною, і прискорити появу клінічних симптомів у матері [19].

Враховуючи роль епігенетичних механізмів, що регулюють диференціацію, міграцію та інвазію клітин трофобласта [20], одним з основних компонентів яких є малі некодуючі РНК (мнкРНК), були проведені численні дослідження з метою оцінки якісного та кількісного складу мікроРНК у жінок з ПЕ порівняно з фізіологічною вагітністю. мікроРНК – це невеликі (близько 20-24 нуклеотидів завдовжки) одноланцюгові молекули, які знижують експресію генів на посттранскрипційному рівні шляхом дестабілізації мРНК та/або пригнічення трансляції білка. Під час вагітності мікроРНК можуть контролювати інвазію та міграцію клітин трофобласта та ангіогенез, зокрема, регулюючи рівні експресії VEGF, sFlt-1 та HIF-1α [21,22]. У плаценті та периферичній крові вагітних з ПЕ виявлено специфічні патерни експресії мікроРНК [23,24]. Winger E. та співавт. проаналізували прогностичний потенціал рівнів експресії 30 мікроРНК у лейкоцитах периферичної крові жінок для прогнозування розвитку ПЕ в 1-му триместрі вагітності за допомогою кількісної ПЛР [25]. Крім того, було проаналізовано склад мікроРНК у плазмі крові вагітних жінок і виявлено, що третина з 368 ідентифікованих мікроРНК не була упакована в екзосоми; лише 8 екзосомних мікроРНК (miR-134, miR-196b, miR-302c, miR-346, miR-376c, miR-486-3p, miR-590-5p та miR-618) вірогідно відрізнялися при ПЕ від фізіологічної вагітності на момент пологів, і з них лише 4 мікроРНК (miR-134, miR-376c, miR-486-3p і miR-590-5p) прогнозували розвиток ПЕ в 1 триместрі вагітності [26]. Громадникова І. та колеги оцінили потенціал miR-516b-5p, miR-517-5p, miR-518b, miR-520a-5p, miR-520h та miR-525-5p в екзосомах плазми крові вагітних для прогнозування ПЕ та гестаційної гіпертензії під час скринінгу в першому триместрі вагітності [27]. Caterina Licini виявила ранній циркулюючий біомаркер ПЕ-miR-125b, який націлений на поверхневий антиген клітин трофобласта ((Trop)-2) і бере участь у регуляції міжклітинної адгезії та клітинної проліферації [28].

Незважаючи на виявлену прогностичну значущість певних мікроРНК у діагностиці розвитку ПЕ на доклінічній стадії, останні дослідження були присвячені лише пПЕ, але не рПЕ, яка характеризується більш тяжким перебігом з несприятливими материнськими та перинатальними наслідками. У зв’язку з вищевикладеним, метою даного дослідження було виявлення тканинно-специфічних молекул мікроРНК плаценти, що мають прогностичне значення в оцінці ймовірності розвитку рПЕ та пПЕ, шляхом аналізу сироватки крові жінок в терміні 11-14 тижнів гестації методом глибокого секвенування з подальшою валідацією за допомогою кількісної ПЛР в реальному часі.

2. Результати

2.1. Пошук плацентоспецифічної позаклітинної мікроРНК в рПЕ та пПЕ під час пологів

На першому етапі дослідження у першій когорті пацієнток (табл. 1) було проаналізовано мікроРНК, які диференціюють рПЕ від пПЕ за профілем експресії в плаценті та плазмі периферичної крові пацієнток на момент пологів. Групу порівняння для аналізу рПЕ склали пацієнтки, які розроджувалися до 34 г (N < 34) через відсутність можливості пролонгування вагітності. До групи порівняння для аналізу пПЕ увійшли пацієнтки з фізіологічним перебігом вагітності (N > 34). Враховуючи можливий вплив різних ускладнень вагітності, що призводять до її переривання, на профіль мікроРНК, ми провели ретельний відбір пацієнток для формування контрольної групи: “N < 34”. До групи “N < 34” для аналізу плаценти та плазми периферичної крові вагітних з рПЕ увійшли пацієнтки з нормальними даними скринінгу 1-го та 2-го триместру вагітності, нормальними показниками фето-плацентарного та матково-плацентарного кровотоку, але ургентним розродженням в терміні 25-32 тижні у зв’язку з витонченням рубця на матці до 1-1. 2 мм за даними УЗД (глибокого дефекту в ділянці рубця не визначалося) після попередніх 1-3 кесаревих розтинів, у поєднанні з істміко-цервікальною недостатністю або без неї та початком регулярної пологової діяльності; з даними клініко-лабораторних методів дослідження, які були в межах норми; з неушкодженими плодовими оболонками під час пологів, при цьому навколоплідні води, що відійшли, були світлими, а ознак хоріоамніоніту не спостерігалося. У жодної пацієнтки з групи “N < 34” не було виявлено патологічних змін морфологічної структури плаценти. Однак, при порівнянні даних секвенування мікроРНК в тканині плаценти в досліджуваних групах ми виявили статистично значущі відмінності в 305 з 577 ідентифікованих мікроРНК в плаценті що точно вказує на гестаційні зміни експресії мікроРНК, підкреслюючи важливість порівняння групи рПЕ або пПЕ з досліджуваними групами. У той же час, при порівнянні даних секвенування мікроРНК у плазмі крові жінок з контрольних груп (N > 34 проти N < 34) не було виявлено статистично значущих змін у вмісті будь-якої мікроРНК.

Таблиця 1. Клінічні характеристики першої когорти пацієнтів.

Примітка: * – всі дані наведені як середні значення (мінімум; максимум).

Профілювання мікроРНК у тканині плаценти та плазмі периферичної крові пацієнток проаналізованих груп проводили за допомогою NGS. При порівнянні списків диференційовано експресованих мікроРНК у тканині плаценти жінок з рПЕ та пПЕ, їхня інтерсекція була або відсутня у випадку мікроРНК, яка проявляє більшу активність (Зображення 1А), або була мінімальною у випадку мікроРНК, яка проявляє меншу активність (Зображення 1B). Важливо відзначити, що переважна більшість мікроРНК, асоційованих з рПЕ або пПЕ, наявних у материнському кровообігу, є плацентарно-специфічними і представлені у зниженому рівні (Зображення 1C і 1D, відповідно). Більше того, у випадку рПЕ не було виявлено жодного підвищеного рівня мікроРНК у плазмі крові (Зображення 1C), тоді як у випадку пПЕ 10 мікроРНК були підвищеними, і з них 4 мікроРНК були плацентарного походження (Зображення 1D). Важливим результатом даного дослідження є наявність різноспрямованих змін рівня експресії більшості мікроРНК при рПЕ та пПЕ в тканині плаценти (Зображення 1E): 186 мікроРНК (список 1) були підвищені в рПЕ і знижені в пПЕ, тоді як 103 мікроРНК (список 2) були знижені в рПЕ і підвищені в пПЕ. Отримані результати відображають патогенетичні відмінності між рПЕ та пПЕ на молекулярному рівні. Тому нам здалося цікавим проаналізувати сигнальні шляхи, на які впливають ці мікроРНК з різноспрямованими змінами рівнів експресії. За допомогою алгоритму Funrich “збагачення мікроРНК” було виявлено 74 сигнальні шляхи-мішені, які є спільними для двох списків мікроРНК (Зображення 1E), але білкові продукти генів-мішеней цих мікроРНК відрізняються, що формують кожен з 74 сигнальних шляхів, були або однаковими, або різними для мікроРНК зі списку 1 та списку 2, як показано для “сигнальних подій CDC42”, сигнальних подій Arf6, сигнальних мереж VEGF та VEGFR, сигнального шляху TRAIL та шляху Glypican. Тобто мікроРНК різних типів зі списків 1 і 2, завдяки різній спрямованості змін рівня експресії у разі раннього ПЕ або пізнього ПЕ, мають протилежні ефекти на гени-мішені одного і того ж сигнального шляху, активність яких залежить від переважного ефекту кожної мікроРНК. Крім того, було ідентифіковано 14 сигнальних шляхів, які регулюються лише мікроРНК зі Списку 1, але не зі Списку 2 (зокрема, епітеліально-мезенхімальний перехід, сигнальний шлях Wnt та неканонічний сигнальний шлях), а також 15 сигнальних шляхів, що регулюються мікроРНК лише зі Списку 2, але не зі Списку 1 (зокрема, шлях EphrinB-EPHB, шлях EphrinA-EPHA, фактори, що беруть участь у розвитку мегакаріоцитів і виробництві тромбоцитів, а також сигнальний шлях EPO). Очевидно, що відмінності в патогенезі рПЕ і пПЕ посилюються наявністю диференційовано експресованих мікроРНК, специфічних для 1 з 2 форм ПЕ: 46 висхідних і 33 низхідних мікроРНК для рПЕ та 38 низхідних і 14 висхідних мікроРНК для пПЕ (Зображення 1E).

Зображення 1. Порівняння диференційованої експресії мікроРНК у плаценті та плазмі крові вагітних з рПЕ та пПЕ на момент пологів за допомогою побудови діаграм Венна-Ейлера та аналізу регульованих ними сигнальних шляхів у програмі Funrich. (А) Пошук перетину списків значно підвищеної активності мікроРНК у плаценті жінок з рПЕ та пПЕ. (B) Пошук перетину списків значно знижених регуляторних мікроРНК у плаценті жінок з рПЕ та пПЕ. (C) Пошук перетинів списків диференційовано експресованих мікроРНК у плаценті та плазмі крові жінок з рПЕ. (D) Пошук перетинів списків диференційовано експресованих мікроРНК у плаценті та плазмі крові жінок з пПЕ. (E) Сигнальні шляхи, регульовані мікроРНК, з різноспрямованими змінами рівнів експресії в тканині плаценти у жінок з рПЕ та пПЕ.

З огляду на величину змін у функціонуванні сигнальних шляхів з незбалансованою експресією мікроРНК, що впливають на них, при ранній і пізній ПЕ, очевидно, що неможливо шукати відмінності в патогенезі двох форм прееклампсії, аналізуючи якийсь один сигнальний шлях. Підказкою до можливості каскадних змін активності сигнальних шляхів у плаценті є зміна вмісту плацентоспецифічної мікроРНК у плазмі крові вагітних. Крім того, важливим є пошук мікроРНК, асоційованих з рПЕ та пПЕ, диференційовано експресованих як на доклінічній стадії маніфестації захворювання, так і на момент розродження порівняно з неускладненим перебігом вагітності. Тому наступним етапом нашого дослідження було порівняння отриманих профілів експресії мікроРНК у плаценті та плазмі крові на момент розродження з такими у сироватці крові жінок у першому триместрі вагітності.

2.2. Ретроспективний аналіз профілю експресії мікроРНК у сироватці крові жінок у першому триместрі вагітності

Ретроспективний аналіз профілів експресії мікроРНК у сироватці крові другої когорти з 40 пацієнток віком від 27 до 40 років у період 11-14 ТГпісля отримання інформації про клінічний діагноз під час пологів (таблиця 2) було проведено методом глибокого секвенування з метою виявлення мікроРНК, асоційованих з розвитком рПЕ та пПЕ на доклінічній стадії. Було сформовано чотири групи пацієнток: (1) десять жінок з низьким ризиком розвитку ПЕ (за програмою Astraia) та фізіологічним перебігом доношеної вагітності (N); (2) дев’ять жінок з високим співвідношенням sFLT-1/PLGF у ІІ та ІІІ триместрах доношеної вагітності без ознак ПЕ (Nhr) (3) десять жінок з маніфестацією ПЕ на 34-37 ТГ(пПЕ); та (4) одинадцять жінок з маніфестацією ПЕ у двадцять п’ять-тридцять три ТГ(рПЕ).

Таблиця 2. Клінічні характеристики другої когорти пацієнток, обстежених у першому триместрі вагітності.

За допомогою програми Deseq було виявлено статистично значуще підвищення рівнів експресії hsa-miR-16-5p (p = 0,00048) та hsa-miR-125b-5p (p = 0,01674) в групі рПЕ відносно групи N, а в групі пПЕ відносно групи N спостерігалося підвищення рівнів hsa-miR-221-3p (p = 0. 00009), hsa-miR-146a-5p (p = 0,00024), hsa-miR-222-3p (p = 0,00075), hsa-miR-21-5p (p = 0,00162), hsa-miR-199a-3p (p = 0,00464), hsa-miR-199b-3p (p = 0,00481), hsa-miR-199a-5p (p = 0. 00585), hsa-miR-30c-5p (p = 0,02807) та hsa-miR-29a-3p (p = 0,03146), а також зниження рівня hsa-miR-1292-5p (p = 0,01780). Через невелику кількість мікроРНК, які достовірно відрізняли ПЕ від N, та відсутність перетину між списками диференційовано експресованих мікроРНК у рПЕ та пПЕ, ми вважали недоцільним будувати логістичні регресійні моделі на основі вмісту цих молекул у сироватці крові з метою оцінки їх прогностичної значущості в генезі ПЕ. Більше того, бажано, щоб ці мікроРНК були плацентоспецифічними, тобто дисбаланс в експресії відображав порушення активності сигнальних шляхів у плаценті, що призводять до розвитку рПЕ або пПЕ. Якщо знайти загальний перелік мікроРНК, які беруть участь у патогенезі як рПЕ, так і пПЕ, але мають різний внесок у подальше виникнення клінічних проявів ПЕ, то технічно буде легше проводити діагностичний тест. З цією метою було оцінено внесок кожної ідентифікованої мікроРНК у розділення зразків за наявністю або відсутністю рПЕ (Зображення 2А) та пПЕ (Зображення 2B) за допомогою часткової регресії за методом найменших квадратів (МНК).

Зображення 2. PLS-аналіз даних NGS щодо кількості зчитувань мікроРНК у зразках сироватки крові пацієнток другої когорти. (А) Розташування зразків сироватки крові жінок з рПЕ та без ПЕ (N). (В) Розташування зразків сироватки крові жінок з пПЕ та без ПЕ (N).

На зображенні 2А,В можна побачити розташування зразків з утворенням чітко просторово відокремлених кластерів, позначених чорними символами (норма) та червоними символами (прееклампсія), де найбільший внесок у це розділення мають мікроРНК із важливістю варіанти (елементу) (VIP) > 1. Слід зазначити, що деякі з мікроРНК показали статистично значущі кореляції їх вмісту в сироватці крові вагітних жінок із середніми рівнями артеріального тиску, β-ХГЛ, ЛПВЩ та індексом пульсації маткових артерій за даними скринінгу першого триместру вагітності (табл. 3 і табл. 4).

Таблиця 3. Кореляційний аналіз рівнів мікроРНК сироватки крові з середнім артеріальним тиском у вагітних у першому триместрі за допомогою непараметричного методу Спірмена та залучення генів-мішеней мікроРНК до патогенезу різних захворювань за даними бази даних miRWalk.

Таблиця 4. Дані непараметричного кореляційного аналізу Спірмена між рівнями мікроРНК у сироватці крові та клініко-лабораторними даними скринінгу першого триместру вагітності, а також участь генів-мішеней мікроРНК у патогенезі різних захворювань за даними бази даних miRWalk.

Пошук взаємодій між мікроРНК та генами, асоційованими з тим чи іншим захворюванням (дані отримані з Alliance of Genome Resources), проводили за допомогою бази даних miRWalk (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/diseases/ (дата звернення 28 січня 2023 р.)). Ми виявили, що більшість мікроРНК, які корелюють із середнім рівнем артеріального тиску у вагітних, впливають на експресію генів-мішеней, залучених до виникнення есенціальної гіпертензії, реноваскулярної гіпертензії та прееклампсії (табл. 3).

У таблиці 4 показано, що мікроРНК, які корелюють з ІПМА, b-ХГЛ та PAPP-A, можуть змінювати експресію генів-мішеней, що беруть участь у виникненні судинних захворювань, плацентарної недостатності та прееклампсії, згідно з даними бази даних miRWalk. Для подальшого розгляду лише плацентарно-специфічних мікроРНК серед молекул було побудовано діаграму Венна-Ейлера (зображення 3) та визначено точки перетину наступних переліків мікроРНК: “диференційовано експресовані мікроРНК у плаценті пацієнток з рПЕ під час пологів”, “циркулюючі мікроРНК, асоційовані з рПЕ на 11-14 ГТ”, “диференційована експресія мікроРНК у плаценті пацієнток з пПЕ під час пологів” та “циркулююча мікроРНК, асоційована з пПЕ на 11-14 ГТ”.

Зображення 3. Діаграма Венна-Ейлера циркулюючої мікроРНК, асоційованої з ПЕ на 11-14 ТГта диференційовано експресованої мікроРНК у плаценті пацієнток з ПЕ під час пологів.

На зображенні 3 показано, що всі мікроРНК, які циркулюють у крові та асоціюються з рПЕ на 11-14 ТГ, є специфічними для плаценти. Серед циркулюючих мікроРНК, асоційованих з пПЕ на 11-14 ТГ, більшість є плацентарно-специфічними, але решта 23 з 249 мікроРНК мають неплацентарне походження. Загалом 137 плацентарно-специфічних мікроРНК, ідентифікованих у сироватці крові в першому триместрі вагітності та асоційованих з рПЕ і пПЕ (виділені червоним кольором на зображенні 3), були розглянуті для подальшого аналізу. За допомогою скрипту, написаного в R-системі для розробки логістичних регресійних моделей, було проаналізовано різні комбінації 137 мікроРНК, вміст яких у сироватці крові на 11-14 тижні гестації ідентифікує пацієнток з високим ризиком розвитку рПЕ та пПЕ за даними NGS. Різні комбінації 4 мікроРНК з найвищою прогностичною цінністю (AUC = 1).

Дані NGS були валідовані за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі з використанням cel-39 (Qiagen) як референтної РНК. Ми відібрали 17 мікроРНК (let-7b-5p, miR-451a, miR-320a-3p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-20a-5p, miR-30e-5p, miR-22-5p, miR-320e, let-7d-3p, miR-146b-5p, miR-148a-3p, miR-519a-3p, miR-99a-5p, miR-1307-3p, miR-26a-5p та miR-1246), які в різних комбінаціях прогнозують розвиток як рПЕ, так і пПЕ. На основі отриманих даних qPCR (значення -∆Ct), були розроблені логістичні регресійні моделі для прогнозування рПЕ (Зображення 4А) та пПЕ (Зображення 4B), порівнюючи їх з вибірками з груп N та Nhr. Об’єднання двох нормальних груп (N і Nhr) у групу порівняння було необхідним для розгляду випадків, коли ризик ПЕ за співвідношенням sFLT/PLGF був високим, але клінічні ознаки ПЕ не починалися до пологів. 

Зображення 4. Логістичні регресійні моделі для прогнозування рПЕ (А) та пПЕ (B) у першому триместрі вагітності за профілями мікроРНК у сироватці крові пацієнток. Кількісні дані ЗТ-ПЛР.

Перші три комбінації мікроРНК, використані для побудови логістичних регресійних моделей, наведені на вкладці Зображення 4А, були здатні прогнозувати розвиток рПЕ в 1-му триместрі вагітності (p < 0,00001, поріг = 0,5) зі 100% чутливістю та 100% специфічністю. Найкращу прогностичну цінність в оцінці ймовірності розвитку рПЕ в 1 триместрі вагітності забезпечило комбіноване виявлення let-7i-5p, miR-320e, miR-519a-3p, miR-1307-3p і miR-17-5p (84% специфічність, 100% чутливість, p < 0. 0001, поріг = 0,159) або комбінації miR-451a, let-7i-5p, miR-320e, miR-519a-3p та miR-17-5p (95% специфічність, 100% чутливість, p < 0,00001, поріг = 0,4628) в моделях логістичної регресії на зображенні 4B, тобто, пПЕ було гіпердіагностовано у 16% або 5% випадків відповідно, тоді як жодного випадку пПЕ не було пропущено (ХНР = 0).

Для оцінки прогностичної значущості біохімічних показників (b-ХГЛ, b-ХГЛ (MoM), PAPP-A, PAPP-A (MoM)), даних УЗД плода (тім’яно-куприковий розмір, ТКР), товщини шийної складки плода (ТШСП), індексу пульсації маткових артерій (ІПМА), ІПМА (MoM), та середнього артеріального тиску (САТ, дн./хв.) під час скринінгу в першому триместрі, були розроблені логістичні регресійні моделі для прогнозування ймовірності виникнення рПЕ (зображення 5А) та пПЕ (зображення 5B) при аналізі другої когорти пацієнток.

Зображення 5. Логістичні регресійні моделі для прогнозування ранньої ПЕ (А) та пізньої ПЕ (В) у першому триместрі вагітності за біохімічними та ультразвуковими даними.

Найкращою моделлю для прогнозування рПЕ та пПЕ в 1-му триместрі вагітності з найнижчим відсотком пропущених випадків ПЕ (ХНР = 5. 3% і ХНР = 21% відповідно) виявилося комбіноване визначення САТ (МоМ) і b-ХГЛ (МоМ), що призводило до хибнопозитивних результатів у 27,3% і 20% випадків при діагностиці рПЕ і пПЕ відповідно. Комбіноване визначення САТ (МоМ), ІПМА (МоМ), b-ХГЛ (МоМ) і PAPP-A (МоМ) зменшило гіпердіагностику рПЕ (ХПР = 18,2%) і пПЕ (ХПР = 10,0%), але збільшило кількість випадків пропущеної ЕТ (ХНР = 10,5% і ХНР = 31,6%, відповідно).

У разі використання кількісного аналізу мікроРНК у сироватці крові (зображення 4А,В) як потенційного додаткового методу прогнозування розвитку ПЕ у жінок, які проходять біохімічне та ультразвукове обстеження в рамках скринінгу першого триместру, необхідно зменшити кількість мікроРНК, які утворюють комбінацію в розроблених логістичних регресійних моделях, для зниження вартості комплексного дослідження. Крім того, нормалізація кількісних даних RT-PCR для кожної мікроРНК до зовнішнього контролю cel-39 (Qiagen) не враховує можливу деградацію РНК до етапу її виділення з біологічного зразка, оскільки вона вноситься в зразок на етапі фенольної екстракції. Для кількісного визначення мікроРНК краще використовувати ендогенний контроль. Крім того, для спрощення процедури тестування зразків необхідна логістична регресійна модель, однакова для прогнозування як рПЕ, так і пПЕ. Тому було вирішено, як альтернативний варіант, побудувати логістичну регресійну модель із залученням біохімічних та ультразвукових параметрів і додати до цієї моделі дві-три молекули мікроРНК для покращення її характеристик. miR-451a, let-7d-3p та miR-1307-3p були обрані для цієї мети з двох основних причин: їх участь у логістичних регресійних моделях для прогнозування рПЕ та пПЕ та відсутність зниження їх концентрації у зразку сироватки крові під час подвійних циклів заморожування/відтавання, на відміну від інших мікроРНК. Концентрація miR-451a, let-7d-3p та miR-1307-3p у зразках сироватки крові не зменшувалася під час подвійного заморожування/відтавання, ймовірно, через їхню здатність упаковуватися в екзосоми, що ми продемонстрували за допомогою глибокого секвенування малих некодуючих РНК з екзосом, отриманих шляхом культивування мезенхімальних стромальних клітин людини (54825 зчитувань для miR-451a та 6707 зчитувань для let-7d-3p, неопубліковані дані) та індукції плюрипотентних стовбурових клітин людини, що диференціюються в гліальному напрямку (643 зчитування для miR-451a та 243 зчитування для miR-1307-3p). Наразі триває робота над секвенуванням малих некодуючих РНК з екзосом сироватки крові пацієнтів когорти 2 цього дослідження з метою виявлення стабільних мікроРНК, які мають прогностичне значення для раннього та пізнього виникнення ПЕ. Отримані дані будуть опубліковані найближчим часом. Крім того, було продемонстровано, що в різних біологічних рідинах, включаючи сироватку крові, стабільність мікроРНК варіювала в широких межах, з періодами напіврозпаду від 1,5 год до понад 13 год, і позитивно корелювала з вмістом GC в послідовності [30]. Кількісне визначення miR-451a та let-7d-3p проводили відносно вмісту miR-1307-3p у зразку, розраховуючи ∆Ct = Ct (miR-451a) – Ct(miR-1307-3p) та ∆Ct = Ct (let-7d-3p) – Ct(miR-1307-3p), оскільки найбільший відсоток GC у послідовності мікроРНК був у miR-1307-3p (73%) порівняно з miR-451a (36%) та let-7d-3p (50%), згідно з даними miRBase. Логістичні регресійні моделі, розроблені для прогнозування ПЕ (рПЕ та пПЕ) при поєднанні біохімічних та ультразвукових параметрів та рівнів miR-451a, let-7d-3p та miR-1307-3p, наведені на зображенні 6.

Зображення 6. Логістичні регресійні моделі для прогнозування ПЕ у першому триместрі вагітності за біохімічними, ультразвуковими показниками та рівнем мікроРНК. (А) Моделі на основі комбінації біохімічних, ультразвукових показників та рівня мікроРНК. (B) Порівняння двох моделей, заснованих на біохімічних/УЗД параметрах з набором даних про рівень мікроРНК або без нього.

Найкращою моделлю для прогнозування ПЕ в 1 триместрі вагітності з найнижчим відсотком пропущених клінічних випадків ПЕ (ХНР = 9,5 %) та найнижчим відсотком хибнопозитивних результатів (ХПР = 15,7 %) виявилося комбіноване визначення miR-451a, let-7d-3p, miR-1307-3p, ІПМА, ІПМА(MoM), b-ХГЛ(MoM) та PAPPA(MoM) (Модель 1 на зображення 6А). На зображення 6B модель 1 з зображення 6А додатково порівнюється з моделлю 2, розробленою з використанням лише біохімічних та ультразвукових параметрів, із зазначенням формул для розрахунку ймовірності виникнення ПЕ для обох моделей. Зображення 6B демонструє, що Модель 2, яка використовує лише біохімічні та ультразвукові параметри, поступається Моделі 1, яка використовує кількісне визначення miR-451a, let-7d-3p та miR-1307-3p у поєднанні з біохімічними та ультразвуковими параметрами (ХНР = 14,3% проти ХНР = 9,5% та ХПР = 36,8% проти ХПР = 15,7% для Моделі 2 порівняно з Моделлю 1).

2.3. Апробація розробленої моделі прогнозування ПЕ у І триместрі вагітності на незалежній когорті пацієнток

На наступному етапі нашого дослідження була використана третя когорта з 48 жінок, які проходили скринінг вагітності в 1 триместрі, для отримання тестового набору даних та оцінки якості розробленої Моделі 1 із зображення 6B, отриманої за допомогою тренувального набору даних від 2-ї когорти з 40 пацієнток. Отримані результати були узагальнені у вигляді таблиці 5, яка також включає результати розрахунку ймовірності ПЕ за програмою Astraia (https://astraia.ru/ (дата звернення: 1 грудня 2022 р.)) та моделлю 2 іх зображення 6В. Як правило, при використанні програми Astraia частота виявлення рПЕ становила 93,9%, пПЕ – 45,6%, а кількість хибнопозитивних результатів – 10,9%.

Таблиця 5. Розрахунок ймовірності виникнення ПЕ за алгоритмом програми Astraia та за формулами моделей 1 і 2 зображення 6В на прикладі тестової когорти вагітних, які проходили скринінг у першому триместрі.

* ND – невизначене значення.

При порівнянні діагнозу на момент пологів та встановленого ризику ПЕ в 1-му триместрі вагітності у пацієнток 3-ї когорти ми виявили, що розроблена формула на основі miR-451a, let-7d-3p, miR-1307-3p, b-hCG(MoM), та рівнях сироваткового АПФР(MoM) та ІПМА і ІПМА(MoM) мала кращу прогностичну цінність, ніж на основі програми Astraia, а саме, кількість хибнопозитивних та хибнонегативних випадків була значно меншою при використанні Моделі 1 Рисунок 6Б у порівнянні з програмою Astraia (ХПР: 26. 7 % проти 62,1 %, ХНР: 5,6 % проти 33,3 %). Слід зазначити, що у 4 з 48 випадків було недостатньо даних для розрахунку ймовірності ПЕ за допомогою програми Astraia. У свою чергу, при порівнянні двох моделей (Модель 1 проти Моделі 2 з Зобр. 6В) на основі біохімічних/ультразвукових параметрів з набором даних про рівень мікроРНК або без нього, ми підтвердили більш точну прогностичну цінність Моделі 1, зокрема, з ХПР = 26,7 % проти ХПР = 62,0 % та ХНР = 5,6 % проти ХНР = 22,2 % (Табл. 5).

Тому питання подальшої оптимізації моделі прогнозування ПЕ на основі молекулярно-біологічних, біохімічних та інструментальних методів дослідження в першому триместрі вагітності залишається актуальним. Одним із потенційних кандидатів як додатковий параметр для моделі 1 на зображення 6 є секреторний кластерин. Згідно з нашим нещодавнім дослідженням [31], розроблені логістичні регресійні моделі на основі рівня секреторного кластерину в екстравезикулярній фракції сироватки крові вагітних першого триместру мають прогностичну значущість в оцінці ймовірності настання рПЕ (AUC = 0,97, Se = 1, Sp = 0,875, зріз = 0,3877) та пПЕ (AUC = 1, Se = 1, Sp = 1, зріз = 0,5).

Сигнальні шляхи, потенційно регульовані мікроРНК-предикторами ПЕ, ідентифікованими в цьому дослідженні (зображення 4), були проаналізовані за допомогою програми FunRich (зображення 7). Серед них були сигнальні шляхи з доведеною роллю в патогенезі ПЕ, а саме: сигнальні шляхи ErbB, EGFR, IGF1, PDGF, TRAIL, mTOR, а також ті, що опосередковані дією фокальної контактної кінази та активатора плазміногену урокіназного типу (зображення 7). Крім того, білкові продукти генів-мішеней ідентифікованих мікроРНК-предикторів ПЕ були переважно регуляторами активності транскрипційного фактора, серин/треонінкінази та убіквітин-специфічної протеази.

Зображення 7. Аналіз сигнальних шляхів, на які впливають мікроРНК-предиктори рПЕ та пПЕ у першому триместрі вагітності.

3. Обговорення

Пошук маркерів для прогнозування ПЕ в першому триместрі вагітності все ще триває через відсутність специфічного клінічно значущого тесту, що використовується в рутинній практиці. Виявлення таких маркерів ускладнюється відмінностями в етіопатогенезі різних форм ПЕ, які визначають ранній або пізній початок клінічних проявів ПЕ після 20-го тижня вагітності. Ще у 2008 році B. Huppertz висунув гіпотезу про патофізіологічні механізми ПЕ, в основі яких лежить порушення диференціювання між клітинами ворсинчастого та/або екстравільозного трофобласту [6], де дисфункція двох основних типів клітин трофобласту призводить до виникнення ПЕ в поєднанні із затримкою розвитку плода, що характерно для ранньої форми ПЕ. При накладанні впливу материнських факторів, таких як генетична схильність, імунологічні фактори, метаболічний синдром, цукровий діабет, хронічна артеріальна гіпертензія, збільшується частота виникнення клінічних проявів ПЕ [19].

У плаценті людини експресуються різні типи мікроРНК, зокрема, специфічні для трофобласта [32,33,34]. Дисбаланс експресії мнкРНК в плаценті на ранніх термінах вагітності може відігравати вирішальну роль у порушенні плацентації. У наших попередніх дослідженнях ми продемонстрували зв’язок між профілем ембріонального секретома, а саме sncRNA, та його імплантаційним потенціалом [35,36,37]. Для відстеження цих порушень необхідний аналіз плацентарно-специфічних мнкРНК у материнській крові.

У цьому дослідженні ми продемонстрували високу прогностичну цінність різних комбінацій let-7b-5p, miR-451a, miR-320a-3p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-20a-5p, miR-30e-5p, miR-22-5p, miR-320e, let-7d-3p, miR-146b-5p, miR-148a-3p, miR-519a-3p, miR-99a-5p, miR-1307-3p, miR-26a-5p та miR-1246; за їх вмістом у сироватці крові жінок у 1 триместрі вагітності можна з високою специфічністю та чутливістю оцінити ймовірність розвитку клінічних симптомів ранньої або пізньої ПЕ після 20 тижнів вагітності (зображення 4). Ці мікроРНК (i) були тканинно-специфічними для тканини плаценти (Зобр. 3), (ii) мали статистично значущі відмінності в рівнях їх експресії в тканині плаценти від пацієнток з ПЕ на момент пологів, робили найбільший вклад в розділення зразків сироватки крові вагітних в 11-14 тижнів гестації, у яких пізніше розвинулися клінічні симптоми ПЕ або не було ознак ПЕ (зображення 2) за даними МНК, та (iv) мали статистично значущі кореляції між їх вмістом у сироватці крові або з середнім рівнем артеріального тиску, або з індексом пульсації маткової артерії, або з b-ХГЛ, або з PAPPA в 11-14 тижнів гестації (табл. 3 і табл. 4). З цих 17 мікроРНК, згідно з базою даних miRWalk, доведено, що 7 мікроРНК причетні до прееклампсії (miR-451a), плацентарної недостатності та прееклампсії (miR-22-5p, miR-1246, miR-146b-5p, miR-320e та miR-1307-3p), плацентарній недостатності, судинних захворюваннях та прееклампсії (miR-20a-5p) через посттранскрипційний вплив на експресію генів-мішеней. Одночасне виявлення 3 мікроРНК (let-7d-3p, miR-451a, та miR-1307-3p), стійких до багаторазового заморожування/відтавання зразків сироватки крові, у поєднанні з біохімічними (b-ХГЛ та PAPP-A) та ультразвуковими (ІПМА) показниками дозволило розробити універсальну модель для прогнозування настання рПЕ та пПЕ (ХПР = 15. 7% та ХНР = 9,5%), валідизовану на тестовій когорті пацієнтів, яка продемонструвала хибнопозитивні результати у 26,7% випадків та хибнонегативні – у 5,6% випадків. Для порівняння, використання загальноприйнятої програми Astraia в аналізі тестової когорти пацієнтів призвело до меншої прогностичної сили: ХПР = 62,1 % і ХНР = 33,3 %.

Добре відомо, що ген сімейства let-7 відіграє ключову роль у розвитку плаценти та плода [38,39], а його рівень контролюється РНК-зв’язуючим білком Lin28, який є природним інгібітором процесингу let-7 на пре-мікроРНК-етапі [40]. У свою чергу, Lin28 безпосередньо збільшує свою активність через Wnt/β-катенін, що відповідає за специфікацію лінії TE через транскрипційний фактор Cdx2 [41]. Водночас, через таргетування Tead4 мікроРНК let-7 впливають на рівень експресії Cdx2, ключового транскрипційного фактора сигнального шляху Hippo, який викликає розвиток трофектодерми через взаємодію з нефосфорильованим YAP1 в ядрі зовнішніх клітин бластоцисти [42]. Показано, що специфічний для трофектодерми нокдаун LIN28A/B підвищує рівень мікроРНК let-7 у бластоцистах і призводить до зниження рівня експресії певних генів-мішеней, відповідальних за проліферацію, інвазію, міграцію, синцитіалізацію, імунну толерантність, ангіогенез і цілісність судин, включаючи гени колагену COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A1 і COL5A2; показано, що разом з RAMP2 всі ці гени залучені до позитивної регуляції каскаду ERK1/2, канонічного Wnt- і TGF-бета, а також генів PPAR-, PI3K-AKT- і сигнальних шляхів Hippo [39]. Встановлено, що рівень мікроРНК let-7 впливає на міграцію та інвазію клітин екстравільозного трофобласту через вплив на рівень експресії їхньої спільної генної мішені MDM4 [43]. Змінені рівні мікроРНК let-7 були виявлені при асоційованих з вагітністю розладах, таких як прееклампсія [44,45]. У даному дослідженні ми виявили статистично значуще зниження рівнів експресії let-7f-5p, let-7c-5p, let-7b-3p, let-7i-5p, let-7a-3p, let -7d-3p і let-7b-5p та підвищення рівнів експресії let-7e-5p і let-7e-3p у плаценті; у плазмі крові виявлено зниження вмісту let-7b-5p у пацієнток з рПЕ на момент розродження. У випадку ПЕ ми виявили статистично значуще підвищення рівня експресії let-7c-5p, let-7i-5p, let-7a-3p, let-7d-3p, let-7b-5p та let-7d-5p, зниження рівня експресії let-7e-5p у плаценті та зменшення вмісту let-7e-5p та let-7a-3p у плазмі крові на момент розродження. Тобто, при порівнянні ранньої та пізньої ПЕ в третьому триместрі вагітності виявлено різну спрямованість змін експресії генів, що кодують мікроРНК let-7c-5p, let-7i-5p, let-7a-3p, let-7d-3p та let-7b-5p в плаценті, що з точки зору їх впливу на проліферацію, диференціацію, інвазію та міграцію клітин трофобласта (див. вище) відображає відмінності в патогенезі двох форм ПЕ. Ці відмінності також підкреслює той факт, що однією з мішеней let-7 є Dicer [46], який контролює біогенез зрілих мікроРНК, а отже, сприяє тонкому налаштуванню рівнів їх численних генів-мішеней, що формують різні сигнальні шляхи в клітині. Аналіз транскриптома сироватки крові вагітних у терміні 11-13 тижнів гестації з подальшим розвитком рПЕ виявив зниження рівнів let-7d-5p, let-7d-3p, let-7f-5p, let-7a-5p, let-7g-5p, let-7i -5p, let-7c-5p, let-7b-3p та let-7e-5p, а також підвищені рівні let-7b-5p і let-7a-3p, тоді як у випадку пПЕ підвищені рівні були виявлені для let-7e-5p, let-7g-5p, let-7f-5p, let-7a-5p, let-7c-5p, let-7i-5p і let-7a-3p, а знижені рівні були виявлені для let-7b-5p, let-7b-3p, let-7d-5p і let-7d-3p. Порівнюючи рПЕ та пПЕ, у сироватці периферичної крові першого триместру виявлено різну спрямованість змін концентрацій let-7f-5p, let-7a-5p, let-7g-5p, let-7i-5p, let-7c-5p та let-7b-5p, що підкреслює патогенетичні відмінності між двома формами ПЕ ще до появи клінічних проявів. Навпаки, у сироватці крові пацієнток з раннім і пізнім ПЕ в першому триместрі виявлено однакову спрямованість змін рівнів let-7d-5p, let-7d-3p, let-7a-3p і let-7b-3p, що вказує на наявність деяких спільних патогенетичних механізмів для двох форм ПЕ. Наприклад, за даними літератури, let-7d-3p впливає на сигнальні шляхи, що регулюють імунну відповідь і запальні процеси, включаючи сигнальний шлях, опосередкований Т-клітинним рецептором, VEGFR і MAPK [47]. Крім того, геном-мішенню let-7d-3p є ДНК-метилтрансфераза 1 (DNMT1), яка регулює метилювання промоторів Notch1, PU.1 та Klf4 – критичних регуляторів поляризації M1/M2 [48].

Імплантація ембріона та подальший розвиток материнсько-плодового інтерфейсу залежать від диференціювання цитотрофобласта плаценти людини першого триместру в екстравіллярний трофобласт шляхом епітеліально-мезенхімального переходу (ЕМП) [49]. Серед мікроРНК, визначених у цьому дослідженні як прогностичні маркери розвитку ранньої та пізньої ПЕ, за даними літератури, в ЕМП беруть участь родини let-7, miR-20a-5p, miR-451a, miR-22-5p та miR-30e-5p. Зокрема, доведено роль осі Wnt/β-катенін-lin28a/let-7 в ЕМП [38]. miR-20a-5p сприяє ЕМП через посилення регуляції експресії мезенхімального маркера віментину та інгібування експресії епітеліального маркера Е-кадгерину через таргетування орфанного ядерного рецептора NR4A3 [50]. miR-451a вважається репресором ЕМП через інгібування металопротеази ADAM10, яка регулює ангіогенез, клітинну міграцію та проліферацію [51]. miR-22 запускає ЕМП шляхом інгібування трансляції SFRP2 та PCDH15, які пригнічують шлях Wnt/b-катеніну, необхідний для росту, інвазії та стовбурових клітин [52]. miR-30e-5p пригнічує проліферацію, міграцію та інвазію клітин через таргетування білка (SNAI1), посилення активності якого є основною характеристикою ЕМП [53]. Крім того, було виявлено, що рівні експресії let-7d-5p і miR-20a-5p були підвищені [54,55], тоді як рівень експресії let-7i-5p був знижений [56] в тканинах плаценти або зразках плазми крові, зібраних у пацієнтів з ПЕ. Крім того, було встановлено, що miR-20a-5p у поєднанні з miR-143-3p, miR-145-5p, miR-146a-5p, miR-181a-5p і miR-574-3p є прогностичними молекулами в оцінці розвитку пізньої ПЕ шляхом визначення їх вмісту в лейкоцитах периферичної крові в першому триместрі вагітності [57].

Відомо, що гіпоксія відіграє різну роль у плацентогенезі залежно від терміну вагітності: у першому триместрі вагітності вона сприяє інвазії трофобласта та ангіогенезу [58], але тривалий гіпоксичний стан після першого триместру спричиняє недостатню синцитіалізацію трофобласта, неадекватну інвазію трофобласта та порушення ремоделювання судин, що призводить до плацентарної дисфункції та гіпертензії, спричиненої вагітністю, такої як прееклампсія/затримка внутрішньоутробного росту [59,60]. Деякі мікроРНК є чутливими до гіпоксії молекулами [61,62,63], серед яких є плацентарно-специфічні мікроРНК, ідентифіковані в даному дослідженні як маркери, що асоціюються з прееклампсією. До них відносяться наступні: mir-30e-5p, що знижує активність за гіпоксичних умов і викликає апоптоз через таргетування Bim [64]; знижений рівень miR-320e, який вважається маркером гострого інсульту у людини [65]; вісь miR-451a/MEF2D, на яку впливають кислі умови за гіпоксії/ішемії, що контролює проліферацію, міграцію та інвазію клітин через сигнальний шлях Akt/GSK-3β [66]; вісь miR-451a/MIF, ключовий регулятор запальних процесів за гіпоксичних умов [67]; miR-22, що індукується внаслідок ішемічно-реперфузійного пошкодження міокарда та здатний інгібувати апоптоз кардіоміоцитів через таргетування білка cAMP клітинного фактора транскрипції (CREB), який регулює проапоптичні гени (Bax та p21) [68]; та miR-1307-3p, що транскрипційно модулюється Hif-1α та сприяє ангіогенезу, клітинній проліферації та інвазії через інгібування DAB2IP та активацію сигналізації AKT/mTOR [69].

Зниження матково-плацентарної перфузії індукує плацентарне вивільнення антиангіогенних факторів у материнський кровообіг, що призводить до ендотеліальної дисфункції та системної судинної дисфункції. Встановлено, що miR-30e-5p може слугувати циркулюючим біомаркером мікросудинної дисфункції, яка пов’язана з цільовою регуляцією генів, відповідальних за біосинтез жирних кислот, що, в свою чергу, призводить до посилення β-окислення жирних кислот, оксидативного стресу та зниження рівня eNOS [70]. За допомогою нокдауну ендогенних мікроРНК в ендотеліальних клітинах людини були ідентифіковані деякі з їхніх генів-мішеней, що беруть участь у регуляції судинної функції та артеріального тиску: FGF5 і ADRB1 для let-7b, let-7c, let-7e і let-7g; ADRA2A і ADRA2B для miR-30e-5p; і ADM, TBX3, EDNBB і NOX4 для miR-92a-3p [71]. Не виключено, що дисбаланс рівнів експресії цих пар мікроРНК/мРНК визначає наявність гіпертензивних розладів при прееклампсії.

Добре відомо, що гіпоксія/ішемія в плаценті є потужним генератором оксидативного стресу, який стимулює підвищену секрецію прозапальних цитокінів, таких як TNFα та IL-1ß, а також призводить до посилення трофобластичного апоптозу [72]. Окислювальний стрес може впливати на рівень експресії певних мікроРНК і, навпаки, мікроРНК можуть змінювати експресію критичних компонентів клітинних антиоксидантів [73]. Наприклад, miR-93 може знижувати рівень Nrf2, який активує транскрипцію генів, що кодують антиоксидантні ферменти [74]. У свою чергу, Nrf2 зв’язується з промотором гена miR-1246, забезпечуючи його експресію [75]. Виявлено значне збільшення експресії генів Nrf2 та miR-1246 під час диференціювання синцитіотрофобласту людини та помітне зниження рівнів їх експресії в плацентах жінок з тяжкою прееклампсією [75]. Важливо відзначити, що гени-мішені miR-1246 є інгібіторами сигналізації WNT/b-катенінів (GSK3b і AXIN2), які мають вирішальне значення для розвитку плаценти. Цей висновок підкреслює важливість використання miR-1246 у нашій моделі логістичної регресії для прогнозування розвитку ранньої та пізньої прееклампсії під час першого скринінгу вагітних жінок.

Існує тісний взаємозв’язок між стресом ЕР та оксидативним стресом у патогенезі прееклампсії [72]: два типи внутрішньоклітинного стресу спричинені ішемією-реперфузією та гіпоксією, а розгорнута білкова відповідь (РБВ) у разі накопичення неправильно згорнутих білків може активувати деякі з тих самих внутрішньоклітинних запальних сигнальних шляхів, що й оксидативний стрес (шляхи NF-κB та p38MAPK). У цьому дослідженні ми визначили miR-1307-3p як ранній прогностичний маркер прееклампсії, що має потенціал впливу на білок метилтрансферази 8 (METTL8), який, у свою чергу, пригнічує експресію KDM3A/3B та зменшує метилювання дев’ятого лізину гістону H3, забезпечуючи таким чином зв’язування P300 та РНК pol II з промоторною ділянкою ендоплазматичного ретикулума UPR ефекторного білка CALR  [76]. Ми виявили зниження рівня miR-1307-3p у сироватці крові жінок з раннім або пізнім ПЕ в першому триместрі , що свідчить про порушення функціонування UPR-сигналізації ендоплазматичного ретикулуму ще до початку клінічних проявів ПЕ. На момент розродження плацентарна тканина жінок з рПЕ мала знижений рівень miR-1307-3p, а у випадку пПЕ – підвищений рівень miR-1307-3p, що, ймовірно, свідчить про усунення компенсаторних механізмів стресу ендоплазматичного ретикулуму та більш пізню маніфестацію симптомів ПЕ порівняно з рПЕ. У нашому нещодавньому дослідженні ми проаналізували сироватку крові вагітних жінок на рівень секреторного кластерину, який є внутрішньо- та позаклітинним шапероном і бере участь у процесах, індукованих стресом ЕР [31]. Виявлено високий ступінь прогнозування розвитку ранньої та пізньої ПЕ за рівнем секреторного кластерину задовго до початку клінічних проявів цих ускладнень вагітності.

Таким чином, плацентоспецифічні мікроРНК, ідентифіковані в даному дослідженні як маркери прогнозування розвитку ранньої та пізньої ПЕ на доклінічній стадії захворювання, беруть участь в основних процесах її патогенезу, а саме: порушенні диференціювання проліферативної та інвазивної здатності клітин цитотрофобласту, що призводить до патологічного ремоделювання спіральних маткових артерій та підвищення їх резистентності, викликаючи гіпоксично-ішемічне пошкодження плацентарної тканини та виникнення оксидативного/стресу ендоплазматичного ретикулуму; запальних реакцій; системного ендотеліозу; поліорганної дисфункції/недостатності. Очевидно, що чим краще ми будемо розуміти патогенез прееклампсії і чим раніше її діагностувати, тим ширшим буде спектр лікарських засобів, які потенційно можуть бути використані для лікування прееклампсії, і тим вищою буде ефективність цих препаратів. Низькі дози аспірину наразі є єдиним профілактичним препаратом, рекомендованим пацієнткам з підвищеним ризиком прееклампсії. Однак гідроксихлорохін пропонується як перспективний препарат для профілактики та лікування прееклампсії, оскільки він чинить протизапальну, антиоксидантну та антитромботичну дію [77].

4. Матеріали та методи

4.1. Пацієнтки

Всього було відібрано 115 пацієнток у віці 25-40 років, які перебували на стаціонарному лікуванні в Національному медичному дослідницькому центрі акушерства, гінекології та перинатології імені академіка В.І. Кулакова у відділенні ведення вагітності та пологів, від яких було отримано інформовану згоду на участь у дослідженні; дослідження було схвалено етичним комітетом Центру. Кожній пацієнтці проводили клінічний та біохімічний аналізи крові, ультразвукове дослідження органів малого тазу та плода, доплерометрію фето-плацентарного кровотоку, кардіотокографію, вимірювання артеріального тиску, визначення рівня білка в сечі, концентрацій PLGF, sFlt-1, PAPP-A та β-ХГЛ в сироватці крові за допомогою діагностичних тест-систем. Критеріями для недопущення до дослідження були настання вагітності за допомогою допоміжних репродуктивних технологій, багатоплідна вагітність, анеуплоїдія плода.

4.2. Виділення РНК з плазми або сироватки крові

Для виділення РНК використовували 200 мкл плазми або сироватки крові, очищеної від клітин та клітинних залишків за допомогою ступінчастого центрифугування при 300× g протягом 20 хв та при 16 000× g протягом 10 хв, з використанням набору miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen, Hilden, Німеччина) після попереднього додавання 5. 6×108 копій синтетичної РНК cel-miR-39 (Qiagen, Hilden, Німеччина) після інкубації плазми/сироватки з реагентом QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Hilden, Німеччина) для контролю ефективності екстракції РНК та синтезу кДНК відповідно до рекомендацій виробника.

4.3. Виділення РНК з тканини плаценти

Зразки плацентарної тканини забирали для дослідження не пізніше ніж через 10 хвилин після пологів. Зріз тканини товщиною 5 мм забирали, проводячи інструмент через всю плаценту від поверхні плода до поверхні матері в місці приблизно на півдорозі між місцем прикріплення пуповини і краєм плаценти в ділянці, вільній від будь-яких очевидних аномалій, як рекомендовано Burton GJ та співавт. [78]. Відібрану плацентарну тканину, вільну від плодових оболонок, промивали в 0,9% NaCl і негайно заморожували в рідкому азоті для подальшого зберігання при -80 °С. Тотальну РНК екстрагували з 20-40 мг плацентарної тканини за допомогою набору miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина) з наступним використанням набору для очищення RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). Концентрацію РНК вимірювали на флуориметрі Qubit 3.0 (Life Technologies, Petaling Jaya, Малайзія). Якість зразків тотальної РНК досліджували за допомогою Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, Вальдбронн, Німеччина) та набору RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Для подальших досліджень використовували зразки тотальної РНК із співвідношенням 28S/18S рибосомної РНК 1,5-1,8.

4.4. мікроРНК Глибоке Секвенування

Бібліотеки кДНК синтезували з використанням 6 мкл елюату колони тотальної РНК (miRNeasy Serum/Plasma Kit), екстрагованого з 200 мкл сироватки або плазми крові, та 500 нг тотальної РНК з тканини плаценти з використанням набору NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set для Illumina® (Set11 та Set2, New England Biolab®, Франкфурт-на-Майні, Німеччина, кат. №№ E7300S та E7580S), ампліфікували за 19 та 14 циклів ПЛР відповідно та секвенували на платформі NextSeq 500 (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія, США, кат. № SY-415-1001). Адаптери видаляли за допомогою Cutadapt. Всі обрізані зчитування, коротші за 16 п.н. і довші за 55 п.н., були відфільтровані, і тільки зчитування із середньою якістю вище 15 були збережені. Решту зчитувань було зіставлено з геномом людини GRCh38.p15 та miRBase v21 за допомогою вирівнювача Bowtie [79]. Підрахунок проводили за допомогою інструменту featureCount з пакету Subread [80] та опції fracOverlap 0.9; таким чином, весь зчитуваний фрагмент повинен був на 90% перетинатися з ознаками мнкРНК. Диференційний експресійний аналіз даних підрахунку кількості мнкРНК проводили за допомогою пакета DESeq2 [81].

4.5. Зворотна транскрипція та кількісна ПЛР у реальному часі

П’ять мікролітрів з чотирнадцяти мкл елюату колонки тотальної РНК (miRNeasy Serum/Plasma Kit, Qiagen, Hilden, Німеччина), виділеної з двохсот мкл сироватки крові, перетворили в кДНК відповідно до протоколу miScript® II RT Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина); потім об’єм зразка доводили до 200 мкл за допомогою деіонізованої води. Синтезовану кДНК (2 мкл) використовували як шаблон для ПЛР у реальному часі з використанням прямого праймера, специфічного до досліджуваної мікроРНК (табл. 6), та набору miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). Використовували наступні умови проведення ПЛР: (1) 15 хв при 95 °С і (2) 50 циклів при 94 °С протягом 15 с, оптимізована температура відпалу (52-62 °С) протягом 30 с і 70 °С протягом 30 с у термоциклері StepOnePlusTM (Applied Biosystems, Waltham, MA, США). Відносну експресію мікроРНК у зразках сироватки крові визначали методом ∆Ct, використовуючи cel-39 як референсну РНК.

Таблиця 6. Характеристики послідовностей мікроРНК, проаналізованих за допомогою ПЛР у реальному часі.

4.6. Статистичний аналіз отриманих даних

Для статистичної обробки використовували скрипти, написані мовою R [80] та RStudio [82]. Відповідність аналізованих параметрів нормальному закону розподілу оцінювали за допомогою критерію Шапіро-Уілка. Коли розподіл даних відрізнявся від нормального, використовували критерій Манна-Уїтні для попарних порівнянь. Оскільки аналізувалися як кількісні, так і якісні характеристики, проводився ранговий кореляційний аналіз з використанням непараметричного кореляційного тесту Спірмена. 95% довірчий інтервал для коефіцієнта кореляції визначався за допомогою перетворення Фішера. Значення порогового рівня значущості (р) було прийнято рівним 0,05.

5. Висновки

Універсальна модель для прогнозування початку рПЕ та пПЕ шляхом одночасного виявлення безклітинних плацентарно-специфічних мікроРНК (let-7d-3p, miR-451a, та miR-1307-3p), стійких до багаторазового заморожування/розморожування зразків сироватки крові в поєднанні з біохімічними (b-ХГЛ та РАРР-А) та ультразвуковими (ІПМА) показниками в І триместрі вагітності, розроблено на навчальній когорті з 40 пацієнток (ХПР = 15. 7% і ХНР = 9,5%), і був валідований на тестовій когорті з 48 пацієнток з хибнопозитивними результатами в 26,7% випадків і хибнонегативними в 5,6% випадків. Для порівняння, використання загальноприйнятої програми Astraia в аналізі тестової когорти пацієнтів призвело до менш прогностичних результатів: ХПР = 62,1% і ХНР = 33,3%. Участь цих мікроРНК у проліферації трофобласта, інвазії, міграції, синцитіалізації, розгорнутій білковій відповіді ендоплазматичного ретикулуму, імунній толерантності, ангіогенезі та цілісності судин, згідно з даними літератури, підкреслює важливість їх використання в якості прогностичних молекул для виявлення ПЕ при скринінгу вагітних у першому триместрі.

Посилання на джерела

1. Burton, G.J.; Redman, C.W.; Roberts, J.M.; Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ 2019, 366, l2381.
2. Ananth, C.V.; Lavery, J.A.; Friedman, A.M.; Wapner, R.J.; Wright, J.D. Serious maternal complications in relation to severe pre-eclampsia: A retrospective cohort study of the impact of hospital volume. BJOG 2017, 124, 1246–1253.
3. Brown, M.A.; Magee, L.A.; Kenny, L.C.; Karumanchi, S.A.; McCarthy, F.P.; Saito, S.; Hall, D.R.; Warren, C.E.; Adoyi, G.; Ishaku, S. The hypertensive disorders of pregnancy: ISSHP classification, diagnosis & management recommendations for international practice. Pregnancy Hypertens. 2018, 13, 291–310.
4. Pierrat, V.; Marchand-Martin, L.; Arnaud, C.; Kaminski, M.; Resche-Rigon, M.; Lebeaux, C.; Bodeau-Livinec, F.; Morgan, A.S.; Goffinet, F.; Marret, S.; et al. Neurodevelopmental outcome at 2 years for preterm children born at 22 to 34 weeks’ gestation in France in 2011: EPIPAGE-2 cohort study. BMJ 2017, 358, j3448.
5. van Beek, P.E.; Rijken, M.; Broeders, L.; Ter Horst, H.J.; Koopman-Esseboom, C.; de Kort, E.; Laarman, C.; Mulder-de Tollenaer, S.M.; Steiner, K.; Swarte, R.M.; et al. Two-year neurodevelopmental outcome in children born extremely preterm: The EPI-DAF study. Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed. 2022, 107, 467–474.
6. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: Challenging the current hypothesis. Hypertension 2008, 51, 970–975.
7. Garrido-Gomez, T.; Dominguez, F.; Quiñonero, A.; Diaz-Gimeno, P.; Kapidzic, M.; Gormley, M.; Ona, K.; Padilla-Iserte, P.; McMaster, M.; Genbacev, O.; et al. Defective decidualization during and after severe preeclampsia reveals a possible maternal contribution to the etiology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114, E8468–E8477.
8. Ruane, P.T.; Berneau, S.C.; Koeck, R.; Watts, J.; Kimber, S.J.; Brison, D.R.; Westwood, M.; Aplin, J.D. Apposition to endometrial epithelial cells activates mouse blastocysts for implantation. Mol. Hum. Reprod. 2017, 23, 617–627.
9. Myatt, L. Review: Reactive oxygen and nitrogen species and functional adaptation of the placenta. Placenta 2010, 31, S66–S69.
10. Pijnenborg, R.; Bland, J.M.; Robertson, W.B.; Brosens, I. Uteroplacental arterial changes related to interstitial trophoblast migration in early human pregnancy. Placenta 1983, 4, 397–413.
11. Burton, G.J.; Woods, A.W.; Jauniaux, E.; Kingdom, J.C.P. Rheological and Physiological Consequences of Conversion of the Maternal Spiral Arteries for Uteroplacental Blood Flow during Human Pregnancy. Placenta 2009, 30, 473–482.
12. James, J.L.; Saghian, R.; Perwick, R.; Clark, A.R. Trophoblast plugs: Impact on utero-placental haemodynamics and spiral artery remodelling. Hum. Reprod. 2018, 33, 1430–1441.
13. Allerkamp, H.H.; Clark, A.R.; Lee, T.C.; Morgan, T.K.; Burton, G.J.; James, J.L. Something old, something new: Digital quantification of uterine vascular remodelling and trophoblast plugging in historical collections provides new insight into adaptation of the utero-placental circulation. Hum. Reprod. 2021, 36, 571–586.
14. Staff, A.C.; Fjeldstad, H.E.; Fosheim, I.K.; Moe, K.; Turowski, G.; Johnsen, G.M.; Alnaes-Katjavivi, P.; Sugulle, M. Failure of physiological transformation and spiral artery atherosis: Their roles in preeclampsia. Am. J. Obstet. Gynecol. 2022, 226, S895–S906.
15. Sidorova, I.S. Solved and unsolved problems of preeclampsia in Russia (Editorial). Russ. Bull. Obstet. 2015, 15, 4–9.
16. Rana, S.; Burke, S.D.; Karumanchi, S.A. Imbalances in circulating angiogenic factors in the pathophysiology of preeclampsia and related disorders. Am. J. Obstet. Gynecol. 2022, 226, S1019–S1034.
17. Haram, K.; Mortensen, J.H.; Myking, O.; Magann, E.F.; Morrison, J.C. The Role of Oxidative Stress, Adhesion Molecules and Antioxidants in Preeclampsia. Curr. Hypertens. Rev. 2019, 15, 105–112.
18. Tomimatsu, T.; Mimura, K.; Matsuzaki, S.; Endo, M.; Kumasawa, K.; Kimura, T. Preeclampsia: Maternal Systemic Vascular Disorder Caused by Generalized Endothelial Dysfunction Due to Placental Antiangiogenic Factors. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 4246.
19. Staff, A.C. The two-stage placental model of preeclampsia: An update. J. Reprod. Immunol. 2019, 134–135, 1–10.
20. Kohan-Ghadr, H.-R.; Kadam, L.; Jain, C.; Armant, D.R.; Drewlo, S. Potential role of epigenetic mechanisms in regulation of trophoblast differentiation, migration, and invasion in the human placenta. Cell Adh. Migr. 2016, 10, 126–135.
21. Skalis, G.; Katsi, V.; Miliou, A.; Georgiopoulos, G.; Papazachou, O.; Vamvakou, G.; Nihoyannopoulos, P.; Tousoulis, D.; Makris, T. MicroRNAs in Preeclampsia. MicroRNA 2019, 8, 28–35.
22. Lv, Y.; Lu, C.; Ji, X.; Miao, Z.; Long, W.; Ding, H.; Lv, M. Roles of microRNAs in preeclampsia. J. Cell. Physiol. 2019, 234, 1052–1061.
23. Xu, P.; Zhao, Y.; Liu, M.; Wang, Y.; Wang, H.; Li, Y.; Zhu, X.; Yao, Y.; Wang, H.; Qiao, J.; et al. Variations of MicroRNAs in Human Placentas and Plasma From Preeclamptic Pregnancy. Hypertension 2014, 63, 1276–1284.
24. Chen, D.; Wang, W. Human placental microRNAs and preeclampsia. Biol. Reprod. 2013, 88, 130.
25. Winger, E.E.; Reed, J.L.; Ji, X.; Nicolaides, K. Peripheral blood cell microRNA quantification during the first trimester predicts preeclampsia: Proof of concept. PLoS ONE 2018, 13, e0190654.
26. Devor, E.; Santillan, D.; Scroggins, S.; Warrier, A.; Santillan, M. Trimester-specific plasma exosome microRNA expression profiles in preeclampsia. J. Matern.-Fetal Neonatal Med. Off. J. Eur. Assoc. Perinat. Med. Fed. Asia Ocean. Perinat. Soc. Int. Soc. Perinat. Obstet. 2020, 33, 3116–3124.
27. Hromadnikova, I.; Dvorakova, L.; Kotlabova, K.; Krofta, L. The Prediction of Gestational Hypertension, Preeclampsia and Fetal Growth Restriction via the First Trimester Screening of Plasma Exosomal C19MC microRNAs. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2972.
28. Licini, C.; Avellini, C.; Picchiassi, E.; Mensà, E.; Fantone, S.; Ramini, D.; Tersigni, C.; Tossetta, G.; Castellucci, C.; Tarquini, F.; et al. Pre-eclampsia predictive ability of maternal miR-125b: A clinical and experimental study. Transl. Res. 2021, 228, 13–27.
29. De La Calle, M.; Delgado, J.L.; Verlohren, S.; Escudero, A.I.; Bartha, J.L.; Campillos, J.M.; Aguarón De La Cruz, A.; Chantraine, F.; García Hernández, J.Á.; Herraiz, I.; et al. Gestational Age-Specific Reference Ranges for the sFlt-1/PlGF Immunoassay Ratio in Twin Pregnancies. Fetal Diagn. Ther. 2021, 48, 288–296.
30. Coenen-Stass, A.M.L.; Pauwels, M.J.; Hanson, B.; Martin Perez, C.; Conceição, M.; Wood, M.J.A.; Mäger, I.; Roberts, T.C. Extracellular microRNAs exhibit sequence-dependent stability and cellular release kinetics. RNA Biol. 2019, 16, 696–706.
31. Timofeeva, A.; Fedorov, I.; Tarasova, A.; Gorina, K.; Suhova, Y.; Gusar, V.; Ivanets, T. Role of clusterin in predicting development of early- and late-onset preeclampsia in the first trimester of pregnancy. Bull. Russ. State Med. Univ. 2022, 60–71.
32. Morales-Prieto, D.M.; Chaiwangyen, W.; Ospina-Prieto, S.; Schneider, U.; Herrmann, J.; Gruhn, B.; Markert, U.R. MicroRNA expression profiles of trophoblastic cells. Placenta 2012, 33, 725–734.
33. Morales-Prieto, D.M.; Ospina-Prieto, S.; Chaiwangyen, W.; Schoenleben, M.; Markert, U.R. Pregnancy-associated miRNA-clusters. J. Reprod. Immunol. 2013, 97, 51–61.
34. Mouillet, J.-F.; Ouyang, Y.; Coyne, C.B.; Sadovsky, Y. MicroRNAs in placental health and disease. Am. J. Obstet. Gynecol. 2015, 213, S163–S172.
35. Timofeeva, A.V.; Fedorov, I.S.; Shamina, M.A.; Chagovets, V.V.; Makarova, N.P.; Kalinina, E.A.; Nazarenko, T.A.; Sukhikh, G.T. Clinical Relevance of Secreted Small Noncoding RNAs in an Embryo Implantation Potential Prediction at Morula and Blastocyst Development Stages. Life 2021, 11, 1328.
36. Timofeeva, A.; Drapkina, Y.; Fedorov, I.; Chagovets, V.; Makarova, N.; Shamina, M.; Kalinina, E.; Sukhikh, G. Small Noncoding RNA Signatures for Determining the Developmental Potential of an Embryo at the Morula Stage. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 9399.
37. Timofeeva, A.V.; Chagovets, V.V.; Drapkina, Y.S.; Makarova, N.P.; Kalinina, E.A.; Sukhikh, G.T. Cell-Free, Embryo-Specific sncRNA as a Molecular Biological Bridge between Patient Fertility and IVF Efficiency. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2912.
38. Li, Q.; Shi, J.; Liu, W. The role of Wnt/β-catenin-lin28a/let-7 axis in embryo implantation competency and epithelial-mesenchymal transition (EMT). Cell Commun. Signal. 2020, 18, 108.
39. Ali, A.; Iqbal, M.A.; Abbas, M.W.; Bouma, G.J.; Anthony, R.V.; Spencer, T.E.; Winger, Q.A. Trophectoderm Transcriptome Analysis in LIN28 Knockdown Ovine Conceptuses Suggests Diverse Roles of the LIN28-let-7 Axis in Placental and Fetal Development. Cells 2022, 11, 1234.
40. Piskounova, E.; Polytarchou, C.; Thornton, J.E.; LaPierre, R.J.; Pothoulakis, C.; Hagan, J.P.; Iliopoulos, D.; Gregory, R.I. Lin28A and Lin28B inhibit let-7 microRNA biogenesis by distinct mechanisms. Cell 2011, 147, 1066–1079.
41. Xie, H.; Tranguch, S.; Jia, X.; Zhang, H.; Das, S.K.; Dey, S.K.; Kuo, C.J.; Wang, H. Inactivation of nuclear Wnt-beta-catenin signaling limits blastocyst competency for implantation. Development 2008, 135, 717–727.
42. Liu, W.; Chen, J.; Yang, C.; Lee, K.-F.; Lee, Y.-L.; Chiu, P.C.-N.; Zhang, Y.; Duan, Y.-G.; Liu, K.; Yeung, W.S.-B. Expression of microRNA let-7 in cleavage embryos modulates cell fate determination and formation of mouse blastocysts†. Biol. Reprod. 2022, 107, 1452–1463.
43. Zhang, L.; Wang, K.; Wu, Q.; Jin, L.; Lu, H.; Shi, Y.; Liu, L.; Yang, L.; Lv, L. Let-7 inhibits the migration and invasion of extravillous trophoblast cell via targeting MDM4. Mol. Cell. Probes 2019, 45, 48–56.
44. Wang, D.; Liu, N.; Tian, Y.; Li, Y.; Shen, X.; Chen, Y.; Wu, F. Expression profile of Let-7s in peripheral blood mononuclear cells of normal and severe preeclampsia pregnant women. Exp. Mol. Pathol. 2019, 110, 104263.
45. Caldeira-Dias, M.; Luizon, M.R.; Deffune, E.; Tanus-Santos, J.E.; Freire, P.P.; Carvalho, R.F.; Bettiol, H.; Cardoso, V.C.; Antonio Barbieri, M.; Cavalli, R.C.; et al. Preeclamptic plasma stimulates the expression of miRNAs, leading to a decrease in endothelin-1 production in endothelial cells. Pregnancy Hypertens. 2018, 12, 75–81.
46. Tokumaru, S.; Suzuki, M.; Yamada, H.; Nagino, M.; Takahashi, T. let-7 regulates Dicer expression and constitutes a negative feedback loop. Carcinogenesis 2008, 29, 2073–2077.
47. Qiu, G.; Fan, J.; Zheng, G.; He, J.; Lin, F.; Ge, M.; Huang, L.; Wang, J.; Xia, J.; Huang, R.; et al. Diagnostic Potential of Plasma Extracellular Vesicle miR-483-3p and Let-7d-3p for Sepsis. Front. Mol. Biosci. 2022, 9, 814240.
48. Yan, J.; Tie, G.; Wang, S.; Tutto, A.; DeMarco, N.; Khair, L.; Fazzio, T.G.; Messina, L.M. Diabetes impairs wound healing by Dnmt1-dependent dysregulation of hematopoietic stem cells differentiation towards macrophages. Nat. Commun. 2018, 9, 33.
49. DaSilva-Arnold, S.C.; Zamudio, S.; Al-Khan, A.; Alvarez-Perez, J.; Mannion, C.; Koenig, C.; Luke, D.; Perez, A.M.; Petroff, M.; Alvarez, M.; et al. Human trophoblast epithelial-mesenchymal transition in abnormally invasive placenta. Biol. Reprod. 2018, 99, 409–421.
50. Yang, H.; Chen, Z.; Liu, Z. MiR-20a-5p Negatively Regulates NR4A3 to Promote Metastasis in Bladder Cancer. J. Oncol. 2021, 2021, 1377989.
51. Xu, Y.; Lai, Y.; Cao, L.; Li, Y.; Chen, G.; Chen, L.; Weng, H.; Chen, T.; Wang, L.; Ye, Y. Human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived exosomal microRNA-451a represses epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by inhibiting ADAM10. RNA Biol. 2021, 18, 1408–1423.
52. Han, M.; Wang, S.; Fritah, S.; Wang, X.; Zhou, W.; Yang, N.; Ni, S.; Huang, B.; Chen, A.; Li, G.; et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain 2020, 143, 512–530.
53. Liang, Z.; Tang, S.; He, R.; Luo, W.; Qin, S.; Jiang, H. The effect and mechanism of miR-30e-5p targeting SNAI1 to regulate epithelial-mesenchymal transition on pancreatic cancer. Bioengineered 2022, 13, 8013–8028.
54. Xu, Q.; Song, Y.; Lu, L. Overexpression of let-7d explains down-regulated KDM3A and ENO2 in the pathogenesis of preeclampsia. J. Cell. Mol. Med. 2021, 25, 8127–8139.
55. Ojeda-Casares, H.; Paradisi, I. The Regulatory Network Played by miRNAs During Normal Pregnancy and Preeclampsia: A Comparative Study. MicroRNA 2021, 10, 263–275.
56. Xu, Y.; Huang, X.; Xie, J.; Chen, Y.; Fu, J.; Wang, L. Let-7i-Induced Atg4B Suppression Is Essential for Autophagy of Placental Trophoblast in Preeclampsia. J. Cell. Physiol. 2017, 232, 2581–2589.
57. Hromadnikova, I.; Kotlabova, K.; Krofta, L. Cardiovascular Disease-Associated MicroRNA Dysregulation during the First Trimester of Gestation in Women with Chronic Hypertension and Normotensive Women Subsequently Developing Gestational Hypertension or Preeclampsia with or without Fetal Growth Restr. Biomedicines 2022, 10, 256.
58. Jauniaux, E.; Watson, A.; Burton, G. Evaluation of respiratory gases and acid-base gradients in human fetal fluids and uteroplacental tissue between 7 and 16 weeks’ gestation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2001, 184, 998–1003.
59. Zhou, H.; Zhao, C.; Wang, P.; Yang, W.; Zhu, H.; Zhang, S. Regulators involved in trophoblast syncytialization in the placenta of intrauterine growth restriction. Front. Endocrinol. 2023, 14, 1107182.
60. Zhao, H.; Wong, R.J.; Stevenson, D.K. The Impact of Hypoxia in Early Pregnancy on Placental Cells. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 9675.
61. Chen, Y.; He, Y.; Zhao, S.; He, X.; Xue, D.; Xia, Y. Hypoxic/Ischemic Inflammation, MicroRNAs and δ-Opioid Receptors: Hypoxia/Ischemia-Sensitive Versus-Insensitive Organs. Front. Aging Neurosci. 2022, 14, 847374.
62. Jiang, H.; Zhao, H.; Zhang, M.; He, Y.; Li, X.; Xu, Y.; Liu, X. Hypoxia Induced Changes of Exosome Cargo and Subsequent Biological Effects. Front. Immunol. 2022, 13, 824188.
63. Mouillet, J.-F.; Chu, T.; Nelson, D.M.; Mishima, T.; Sadovsky, Y. MiR-205 silences MED1 in hypoxic primary human trophoblasts. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 2010, 24, 2030–2039.
64. Mo, B.; Wu, X.; Wang, X.; Xie, J.; Ye, Z.; Li, L. miR-30e-5p Mitigates Hypoxia-Induced Apoptosis in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Suppressing Bim. Int. J. Biol. Sci. 2019, 15, 1042–1051.
65. Wang, W.; Sun, G.; Zhang, L.; Shi, L.; Zeng, Y. Circulating microRNAs as novel potential biomarkers for early diagnosis of acute stroke in humans. J. Stroke Cerebrovasc. Dis. Off. J. Natl. Stroke Assoc. 2014, 23, 2607–2613.
66. Xu, J.; Li, Y.; Li, Z.; Shao, W.; Song, J.; Wei, J. Acidic Tumor Microenvironment Promotes Pancreatic Cancer through miR-451a/MEF2D Axis. J. Oncol. 2022, 2022, 3966386.
67. Scrimgeour, N.R.; Wrobel, A.; Pinho, M.J.; Høydal, M.A. microRNA-451a prevents activation of matrix metalloproteinases 2 and 9 in human cardiomyocytes during pathological stress stimulation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2020, 318, C94–C102.
68. Yang, J.; Chen, L.; Yang, J.; Ding, J.; Li, S.; Wu, H.; Zhang, J.; Fan, Z.; Dong, W.; Li, X. MicroRNA-22 targeting CBP protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through anti-apoptosis in rats. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 555–561.
69. Chen, S.; Liu, R.; Wang, H.; Liu, Q. Hypoxia-driven miR-1307-3p promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation and invasion by modulating DAB2 interacting protein. Pathol. Res. Pract. 2022, 237, 154066.
70. Veitch, S.; Njock, M.-S.; Chandy, M.; Siraj, M.A.; Chi, L.; Mak, H.; Yu, K.; Rathnakumar, K.; Perez-Romero, C.A.; Chen, Z.; et al. MiR-30 promotes fatty acid beta-oxidation and endothelial cell dysfunction and is a circulating biomarker of coronary microvascular dysfunction in pre-clinical models of diabetes. Cardiovasc. Diabetol. 2022, 21, 31.
71. Kriegel, A.J.; Baker, M.A.; Liu, Y.; Liu, P.; Cowley, A.W.J.; Liang, M. Endogenous microRNAs in human microvascular endothelial cells regulate mRNAs encoded by hypertension-related genes. Hypertension 2015, 66, 793–799.
72. Burton, G.J.; Yung, H.-W.; Cindrova-Davies, T.; Charnock-Jones, D.S. Placental endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in the pathophysiology of unexplained intrauterine growth restriction and early onset preeclampsia. Placenta 2009, 30 (Suppl. A), S43–S48.
73. Carbonell, T.; Gomes, A. V MicroRNAs in the regulation of cellular redox status and its implications in myocardial ischemia-reperfusion injury. Redox Biol. 2020, 36, 101607.
74. Chen, Q.M.; Maltagliati, A.J. Nrf2 at the heart of oxidative stress and cardiac protection. Physiol. Genom. 2018, 50, 77–97.
75. Muralimanoharan, S.; Kwak, Y.-T.; Mendelson, C.R. Redox-Sensitive Transcription Factor NRF2 Enhances Trophoblast Differentiation via Induction of miR-1246 and Aromatase. Endocrinology 2018, 159, 2022–2033.
76. Xie, S.; Jiang, X.; Qin, R.; Song, S.; Lu, Y.; Wang, L.; Chen, Y.; Lu, D. miR-1307 promotes hepatocarcinogenesis by CALR-OSTC-endoplasmic reticulum protein folding pathway. iScience 2021, 24, 103271.
77. Deharde, D.; Klockenbusch, W.; Schmitz, R.; Brand, M.; Köster, H.A.; de Murcia, K.O. Hydroxychloroquine as a Preventive and Therapeutic Option in Preeclampsia—A Literature Review. Geburtshilfe Frauenheilkd. 2020, 80, 679–685.
78. Burton, G.J.; Sebire, N.J.; Myatt, L.; Tannetta, D.; Wang, Y.-L.; Sadovsky, Y.; Staff, A.C.; Redman, C.W. Optimising sample collection for placental research. Placenta 2014, 35, 9–22.
79. Langmead, B.; Trapnell, C.; Pop, M.; Salzberg, S.L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009, 10, R25.
80. Team, R.D.C. A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Available online: https://www.r-project.org (accessed on 10 March 2021).
81. Love, M.I.; Huber, W.; Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014, 15, 550. [Google Scholar] [CrossRef]
82. Team, R.S. RStudio: Integrated Development for R. RStudio. Available online: http://www.rstudio.com/ (accessed on 23 March 2021).