Визуализация метаболического перепрограммирования метаболической сети синтеза жирных кислот открывает новые диагностические и терапевтические возможности для лечения рака молочной железы

Резюме

Предусловия

Перепрограммированная метаболическая сеть является ключевым признаком рака. Профилирование метаболических изменений рака с помощью пространственных сигнатур не только дает ключи к пониманию биохимической гетерогенности рака, но и помогает расшифровать возможную роль метаболического перепрограммирования в развитии рака.

Методы

Для характеристики экспрессии жирных кислот в тканях рака молочной железы использовали метод масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ). Специфическое иммунофлуоресцентное окрашивание было применено для исследования экспрессии ферментов, связанных с синтезом жирных кислот.

Результаты

Было определено распределение 23 жирных кислот в тканях рака молочной железы, и оказалось, что уровень большинства жирных кислот в раковых тканях значительно выше, чем в соседних нормальных тканях. Обнаружено, что два метаболических фермента, синтаза жирных кислот (FASH) и ацетил КоА карбоксилаза (ACC), которые участвуют в синтезе жирных кислот de novo, подвергаются чрезмерной активации при раке молочной железы. Направленное снижение активности FASN и ACC является эффективным подходом к ограничению роста, пролиферации и метастазирования клеток рака молочной железы.

Выводы

Эти данные углубляют наше понимание метаболического перепрограммирования рака и дают представление об изучении метаболических уязвимостей для лучшего лечения рака.

Предусловия

Рак молочной железы вытеснил рак легких на первое место среди онкологических заболеваний в мире: в 2020 году было зарегистрировано 2,26 миллиона новых случаев заболевания во всем мире [1]. Он также занимает первое место среди новых случаев заболевания и смертности от рака у женщин [2]. Важной особенностью опухолевых клеток является то, что они могут перепрограммировать свои метаболические сети для поддержки синтеза макромолекул и энергетических соединений, необходимых для роста, пролиферации и метастазирования опухоли [3, 4]. Метаболическое перепрограммирование рака молочной железы также тщательно изучалось многими исследователями. Например, раковые клетки молочной железы демонстрируют типичные признаки эффекта Варбурга. Они переводят путь метаболизма глюкозы с митохондриального окислительного фосфорилирования на аэробный гликолиз для быстрой выработки энергии [5, 6]. Метаболические ферменты, связанные с трансмембранным транспортом глюкозы и гликолизом, такие как глюкозный транспортер 1 (GLUT1) и гексокиназа 2 (HK2), высоко экспрессируются в клетках рака молочной железы [7, 8]. По сравнению с нормальными клетками, раковые клетки молочной железы обычно имеют более низкий уровень глюкозы и более высокий уровень молочной кислоты [9]. Кроме того, клетки рака молочной железы также демонстрируют сильную зависимость от глутамина. Появляется все больше доказательств того, что глутаминаза (GLS), ключевой фермент, регулирующий метаболизм глутамина, увеличивает свою активность в клетках рака молочной железы, что приводит к чрезмерному использованию глутамина в раковых клетках молочной железы [10, 11]. В предыдущих исследованиях мы обнаружили, что карнитин и опосредованный карнитиновой системой путь β-окисления жирных кислот значительно перепрограммированы в раковых тканях молочной железы [12]. L-карнитин, короткоцепочечные ацилкарнитины и три карнитин-опосредованные ферменты: карнитин-пальмитоилтрансфераза 1 А (CPT1A), карнитин-пальмитоилтрансфераза 2 (CPT2) и карнитин-ацетилтрансфераза (CRAT) были более активными в тканях рака молочной железы.

Жирные кислоты являются важными строительными блоками клеточных фосфолипидов и гликолипидов. Синтез жирных кислот de novo является незаменимым метаболическим путем, который превращает питательные вещества в метаболические промежуточные продукты для формирования клеточных мембран, энергетического обмена и передачи сигналов [13, 14]. Новые исследования указывают на то, что изменение пути синтеза жирных кислот тесно связано с возникновением, развитием и метастазированием рака молочной железы [15,16,17,18,19]. Park и соавт. обнаружили, что уровень докозагексаеновой кислоты в крови больных раком молочной железы был значительно ниже, чем у здоровых лиц, и что докозагексаеновую кислоту можно использовать как потенциальный диагностический маркер рака молочной железы [20]. Xu и соавт. показали, что синтаза жирных кислот может способствовать миграции клеток рака молочной железы, регулируя изменения в метаболизме жирных кислот [18]. Также сообщалось, что уровень полиненасыщенных n-3 жирных кислот в жировой ткани молочной железы тесно связан с мультифокальностью рака молочной железы [21]. Однако следует отметить, что ткани рака молочной железы очень гетерогенны, и очень важно точно охарактеризовать пространственное распределение жирных кислот в различных микрорегионах раковой ткани. Масс-спектрометрическая визуализация (МСВ) – это метод без меток, который позволяет не только выявлять содержание метаболитов, но и непосредственно картографировать пространственное распределение метаболитов в биологических тканях [22, 23]. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ) и десорбционная электроспрей ионизация (ДЭСИ)-МСВ в настоящее время являются наиболее распространенными методами МСВ, а максимальное пространственное разрешение может достигать 1,4 мкм [24,25,26,27]. Они показали очень ценные перспективы применения для характеристики пространственно-временной метаболической сети опухолей, диагностики возникновения рака и выяснения терапевтического действия противоопухолевых препаратов [28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38].

Целью этого исследования является визуализация пространственных изменений жирных кислот и путей их синтеза в гетерогенных тканях рака молочной железы, а также выявление потенциальных метаболических нарушений, которые могут быть использованы для терапии рака. Сочетая пространственно-расширенный МАЛДИ-МСВ и метод иммунофлуоресценции, мы обнаружили, что экспрессия жирных кислот и связанных с их синтезом ферментов – синтазы жирных кислот (FASN) и ацетил КоА-карбоксилазы (ACC) – в тканях рака молочной железы значительно выше, чем в прилегающих нормальных тканях. Многомерная статистическая классификационная модель, построенная на основе пространственной экспрессии жирных кислот, может точно идентифицировать ткани рака молочной железы и прилегающие нормальные ткани. Кроме того, мы обнаружили, что целенаправленное подавление активности FASN и ACC является эффективным подходом для ограничения роста, пролиферации и метастазирования клеток рака молочной железы. Изучение пространственных признаков и изменений жирных кислот и их синтетического пути de novo в гетерогенных раковых тканях может дать важное понимание того, как можно целенаправленно влиять на метаболизм жирных кислот.

Методы

Сбор образцов тканей рака молочной железы человека

Все эксперименты были одобрены Институциональным советом по этической экспертизе Шаньдунского онкологического госпиталя и института (№ 201,907,005). 60 образцов тканей рака молочной железы были получены путем хирургического вмешательства. Послеоперационные образцы ткани рака молочной железы включают раковые участки и прилегающие нормальные участки. Перед проведением экспериментов МАЛДИ-МСВ все собранные образцы тканей хранили в холодильнике при температуре -80 °C.

Обработка образцов тканей

Пять наборов смежных замороженных срезов ткани толщиной 10 мкм готовили при -25 °C с помощью криостата NX50 NOVPD (Thermo Fisher Scientific). Один из срезов ткани использовали для гистологического исследования. Другие два среза использовали для анализа МАЛДИ-МСВ. Последние два среза использовали для иммунофлуоресцентного окрашивания. Срезы тканей для гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания были разморожены на предметных стеклах микроскопа Superfrost™ plus. Срезы тканей, используемые для анализа МАЛДИ-МСВ, необходимо разморозить на предметных стеклах, покрытых оксидом индия и олова.

Покрытие матрицы и анализ МАЛДИ-МСВ

Перед распылением матрицы срезы тканей на предметных стеклах высушивали в вакууме в течение 15 минут. Для выявления большего количества жирных кислот мы сравнили результаты МАЛДИ-МСВ жирных кислот с 9-АА, 1,5-DAN и BNDM в качестве матрицы соответственно. Восемь проходов 9-АА (10,0 мг/мл), восемь проходов 1,5-ДАН (2,0 мг/мл) и двенадцать проходов BNDM (1,0 мг/мл) были распылены на три прилегающих участка ткани с помощью распылителя HTX TM-Sprayer™. Скорость потока матричного раствора, температура сопла и давление распыления были установлены на 0,075 мл/мин, 55 °C и 10 фунтов на квадратный дюйм, поочередно. Расстояние между дорожками составляло 3 мм, а скорость движения дорожек – 80 см/мин. После распыления матрицы мы использовали масс-спектрометр MALDI tissuetyper™ TOF/TOF (Bruker Daltonics) для проведения экспериментов МАЛДИ-МСВ. Масс-спектры были собраны в диапазоне m/z 80 ~ 1000 в режиме отрицательных ионов. Пространственное разрешение составляло 100 мкм. 3D лазер Smartbeam™ излучал с частотой 5000 Гц.

Иммуногистохимия

Для исследования пространственной экспрессии FASN и ACC в срезах ткани рака молочной железы два набора срезов ткани подвергали иммунофлуоресцентному анализу. После фиксации в 4% растворе параформальдегида в течение 15 минут срезы ткани рака молочной железы инкубировали с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 30 минут. Затем эти срезы ткани инкубировали с антителами FASN (Abcam Cat# ab128870, RRID: AB_11143436, 1:200) и антителами ACC (Abcam Cat# ab109368, RRID: AB_10864809, 1:100) в течение ночи в инкубаторе при 4 °C. Затем срез ткани инкубировали со вторичным антителом в течение 50 минут, после чего ядро окрашивали DAPI. К срезам ткани добавляли AutoFluo Quencher еще на 5 минут. Наконец, срезы помещали под сканер (3DHISTECH) для получения изображений.

Клеточная культура и лечение

Клеточная линия рака молочной железы человека MDA-MB-231 была получена из Банка клеток Шанхайского института биохимии и клеточной биологии (Китайская академия наук). Клетки культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) (KeyGen Biotech) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) (Gibco) и 100 ЕД/мл антибиотиков (пенициллина и стрептомицина) при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Когда слияние клеток достигало 80-90%, добавляли TVB-2640 (Selleck, S9714) и/или PF-05175157 (Selleck, S6672) соответственно. Через 24 часа жизнеспособность клеток определяли с помощью теста CCK-8 и теста на образование колоний, пролиферацию клеток отображали с помощью окраски EdU и ядерной окраски DAPI, а миграцию клеток контролировали с помощью анализа заживления ран.

Анализ данных

Изображения МАЛДИ-МСВ были построены и обработаны с помощью программного обеспечения SCiLS Lab 2018b (SCiLS GmbH). Региональные профили жирных кислот были получены в SCiLS Lab. Анализ главных компонент, ортогональный дискриминационный анализ по методу наименьших квадратов, частичный дискриминационный анализ по методу наименьших квадратов и статистическое прогнозирование выполняли с помощью программного пакета SIMCA-P (версия 14.0, Umetrics AB). Анализ кривых рабочих характеристик приемника и t-тест проводили в программном обеспечении GraphPad Prism (версия 6.0). Иммунофлуоресцентные изображения обрабатывали с помощью программы CaseViewer (3D Histech).

Результаты

Разработка метода масс-спектрометрической визуализации с высоким покрытием для картирования пространственного распределения жирных кислот в раковых тканях молочной железы

Послеоперационные раковые ткани молочной железы были разрезаны на сплошные срезы, один из которых был использован для гистологической окраски. Как показано на рис. 1а, послеоперационный срез ткани рака молочной железы содержит не только раковые участки, но и нормальные участки, прилегающие к раковым. Как важный компонент клеточной архитектуры, жирные кислоты также играют решающую роль в передаче клеточных сигналов и энергетическом метаболизме. Картирование пространственного распределения жирных кислот в гетерогенных тканях рака молочной железы является важным для нашего понимания биосинтеза и метаболизма жирных кислот.

МАЛДИ-МСВ предлагает инсайдерский подход к визуализации пространственного распределения метаболитов в гетерогенных биологических тканях. Однако, выбор матрицы МАЛДИ является ключевым фактором для визуализации метаболитов. Учитывая, что жирные кислоты содержат в своей структуре карбоксильную группу, анализ МАЛДИ-МСВ целесообразнее проводить в режиме детектирования отрицательных ионов. 9-Аминоакридин (9-АА) и 1,5-диаминонафталин (1,5-DAN) – две широко используемые матрицы МАЛДИ в режиме отрицательных ионов. 1,1′-Бинафтил-2,2′-диамин (BNDM) – двухполярная матрица, разработанная нашей группой, которая может облегчить обнаружение 301 отрицательных и 175 положительных ионов метаболитов в биологических тканях [39]. В этой работе мы сравнили эффективность масс-спектрометрического изображения жирных кислот в срезах тканей рака молочной железы с использованием 9-АА, 1, 5-DAN и BNDM в качестве матриц соответственно (рис. 1b). МС-изображения репрезентативных жирных кислот (ЖК), таких как ЖК-16:1 ([M-H]-, m/z 253,2), ЖК-18:1 ([M-H]-, m/z 281,2), ЖК-20:4 ([M-H]-, m/z 303. 2), ЖК-20:3 ([M-H]-, m/z 305.2), ЖК-22:6 ([M-H]-, m/z 327.2) и ЖК-22:5 ([M-H]-, m/z 329.2) в срезах ткани рака молочной железы проиллюстрировано на рис. 1c – рис. 1h. Когда 9-АА использовали в качестве матрицы МАЛДИ, ЖК демонстрировали очень слабые сигналы МС. Хотя многие ЖК можно было обнаружить и визуализировать, используя 1, 5-DAN в качестве матрицы МАЛДИ, МС-сигнал ЖК значительно усиливался, когда в качестве матрицы использовали BNDM. Учитывая это, мы выбрали BNDM в качестве матрицы для МАЛДИ-МСВ ЖК в тканях рака молочной железы. При использовании BNDM в качестве матрицы МАЛДИ было обнаружено 23 ЖК, в том числе одну ЖК C14 (ЖК -14:1), три ЖК C16 (ЖК -16:0, ЖК-16:1, ЖК -16:2), четыре ЖК C18 (ЖК-18:0, ЖК-18:1, ЖК -18:2, ЖК -18:3), шесть ЖК C20 (ЖК -20:0, ЖК-20:1, ЖК-20. 2, ЖК-20.3, ЖК-20.4, ЖК-20.5), семь С22 ЖК (FA-22.0, ЖК-22.1, ЖК-22.2, ЖК-22.3, ЖК-22.4, ЖК-22.5, ЖК-22.6) и две С24 ЖК (ЖК-24.0, ЖК-24.1). Насколько нам известно, именно этот метод масс-спектрометрической визуализации обнаруживает наибольшее количество ЖК в биологических тканях.

Рисунок 1. H&E – Гематоксилин и эозин; Adjacent sections – смежные срезы
(а) Гистологическая окраска и оптическое изображение среза ткани рака молочной железы. (b) Распыление 9-АА, 1, 5-DAN и BNDM на смежные срезы ткани рака молочной железы. (c-h) МС-изображения репрезентативных жирных кислот (ЖК) в срезах ткани рака молочной железы с использованием 9-АА, 1, 5-DAN и BNDM в качестве матриц МАЛДИ

Экспрессия ЖК значительно повышена в тканях рака молочной железы

Используя метод МАЛДИ-МСВ с высоким покрытием, мы проанализировали экспрессию ЖК в послеоперационных тканях 60 пациенток с раком молочной железы. Большинство послеоперационных образцов содержат как раковые, так и нормальные ткани. На рис. 2а показаны типичные изображения окраски двух тканей рака молочной железы, и граница между раковыми и нормальными участками может быть точно разграничена. После проведения МАЛДИ-МСВ анализа мы выделили 246 масс-спектров раковых участков и 207 масс-спектров нормальных участков из 60 образцов тканей рака молочной железы на основе гистологического изображения. Результаты показали, что экспрессия большинства жирных кислот в области рака была значительно выше, чем в парной нормальной области. На рис. 2b – рис. 2h показаны МС-изображения и статистические результаты семи наиболее регулируемых жирных кислот в области рака молочной железы. Уровни ЖК-20:3 и ЖК-16:1 в области рака молочной железы выросли почти в 7 раз по сравнению с нормальной областью (рис. 2d и e). Содержание ЖК-20:2 и ЖК-20:1 увеличилось в 5,85 раз и 5,67 раз в зоне рака отдельно (рис. 2с и е). Увеличение содержания ЖК-18:1, ЖК-22:4 и ЖК-14:0 также достигло 4,18, 3,71 и 3,63 раза, отдельно (рис. 2b, h и g).

Кроме того, для изучения эффективности выявления ЖК в различении рака молочной железы и нормальных участков использовали анализ кривых операционной характеристики приемника (ROC) для изучения полезности ЖК в различении рака молочной железы и нормальных участков. Эффективность ROC-кривой оценивали по площади под кривой (ППК). ROC-кривые, построенные на основе ЖК-18:1, ЖК-20:2, ЖК-20:3, ЖК-16:1, ЖК-20:1, ЖК-14:0 и ЖК-22:4, показали хорошую дискриминационную способность со значениями ППК 0,984, 0,982, 0,967, 0,951, 0,928, 0,943 и 0,918 соответственно (рис. 2b – рис. 2h). Эти результаты указывают на то, что содержание вышеупомянутых семи ЖК имеет высокую диагностическую ценность для диагностики рака молочной железы.

Рисунок 2. (a) Гистограммы двух репрезентативных срезов тканей рака молочной железы, окрашенных с помощью H&E. (b-h) МС-изображения, статистические результаты и ROC-кривые семи репрезентативных жирных кислот в тканях рака молочной железы (nnormal, 207; ncancer, 246). Масштаб оси y – log 2; ***, p < 0,001

Молекулярная идентификация и диагностика ткани рака молочной железы на основе экспрессии ЖК

Для дальнейшего изучения потенциальной ценности жирных кислот в выявлении и диагностике рака молочной железы мы провели многомерный статистический анализ на основе профилей жирных кислот 246 участков пораженных раком молочной железы и 207 прилегающих нормальных участков. Для исследования глобальной тенденции кластеризации и группировки рака молочной железы и прилегающих здоровых участков впервые был проведен неконтролируемый анализ главных компонент (АГК). Хотя существовало некоторое перекрытие между раком молочной железы и прилегающими нормальными участками, тенденция к группировке в раковых и нормальных участках была очень очевидной. Кроме того, мы провели контролируемый ортогональный частичный дискриминационный анализ наименьших квадратов (ОЧНК-ДА), который может полностью отразить различия между раковыми и нормальными участками путем добавления искусственной информации о группировке. На рис. 3а показана модель ОЧНК-ДА, построенная на основе данных МАЛДИ-МСВ 23 ЖК. Модель продемонстрировала очень хорошие группировочные характеристики, с Q2 значением 0,824 для одного прогностического и трех ортогональных [1 + 3] компонентов, R2 (X) значением 0,814 и R2 (Y) значением 0,83. Затем мы провели тест на случайную перестановку с частичным дискриминационным анализом наименьших квадратов (ЧНК-ДА), чтобы оценить валидность этой модели ОЧНК-ДА. Модель теста на перестановку была получена с перехватами Q2 = -0,126 и R2 = 0,01, что указывает на то, что ОЧНК-ДА не перенастраивается (рис. 3b).

Рисунок 3. (a) Графики оценки ОЧНК-ДА на основе данных МАЛДИ-МСА для 23 жирных кислот в раковых тканях молочной железы и парных нормальных тканях (нормальные, 207; раковые, 246). (b) Графики валидации ЧНК, полученные на основе 100 тестов перестановок

Далее мы построили классификационную модель ОЧНК-ДА для определения категории образцов на основе экспрессии ЖК. 246 масс-спектров тканей пораженных раком и 207 масс-спектров нормальных тканей были случайным образом разделены на две партии. Первая группа включала 123 масс-спектра тканей пораженных раком и 103 масс-спектра нормальных тканей, а вторая группа содержала 123 масс-спектра тканей пораженных раком и 104 масс-спектра нормальных тканей. Данные из первой группы были использованы для построения модели ОЧНК-ДА. Как показано на рис. 4а, модель ОЧНК-ДА показала хорошую тенденцию к кластеризации и группировке со значением Q2 0,85, R2 (X) 0,773 и R2 (Y) 0,866. Затем образцы из второй партии были взяты как неизвестные образцы и введены в модель ОЧНК-ДА для выполнения классификационного анализа (рис. 4b). На рис. 4c – рис. 4e проиллюстрированы прогнозируемые результаты на второй группе препаратов. В целом два опухолевых участка были ошибочно идентифицированы как нормальные участки (стрелки на рис. 4c), а два нормальных образца были ошибочно оценены как образцы рака (стрелки на рис. 4d). Общая точность классификации для всех этих 227 случаев образцов (123 раковых образцов и 104 нормальных образцов) достигла 98,2% (рис. 4e).

Рисунок 4. Статистическое прогнозирование рака молочной железы на основе классификационной модели ОЧНК-ДА. (a) Графики оценки ОЧНК-ДА на основе данных МАЛДИ-МСВ 23 жирных кислот в тканях рака молочной железы и нормальных тканях партии (1) (b) Профили МАЛДИ-МС 23 жирных кислот в тканях рака молочной железы и нормальных тканях группы (2) (c) Прогнозируемые результаты тканей рака молочной железы из группы 2. (d) Прогнозируемые результаты нормальных тканей молочной железы из группы 2. (e) Матрица путаницы модели ОЧНК-ДА, показывающая результаты классификации тканей рака молочной железы из группы 2.

Визуализация и корреляция пространственных особенностей жирных кислот и метаболических ферментов, связанных с синтезом жирных кислот, в тканях рака молочной железы

В этом исследовании мы обнаружили, что экспрессия большинства жирных кислот в тканях рака молочной железы была значительно выше, чем в соседних нормальных тканях. Как правило, раковые клетки пытаются улучшить биосинтез эндогенных метаболитов, чтобы удовлетворить свою бесконечную пролиферацию. С точки зрения биосинтеза, синтез жирных кислот de novo требует двух основных этапов (рис. 5а): (i) АСС катализирует образование малонил-КоА из ацетил-КоА; (ii) после 7 циклов прайминга, загрузки, конденсации, восстановления, дегидратации, восстановления и гидролиза одна молекула ацетил-КоА и семь молекул малонил-КоА непрерывно конденсируются в пальмитиновую кислоту под катализом FASN. Пальмитиновая кислота (ПМА, ЖК-16:0) является первой жирной кислотой, синтезированной de novo, и она может продолжать денатурироваться и элонгироваться в несколько типов жирных кислот с различной степенью насыщенности и длиной.

Пальмитиновая кислота показала гораздо более высокую интенсивность ионов в пораженном участке, чем в соседнем нормальном участке в срезах ткани рака молочной железы (рис. 5b и c). ACC и FASN являются двумя ферментами, ограничивающими скорость синтеза пальмитиновой кислоты. Мы предположили, что усиление регуляции синтеза пальмитиновой кислоты и других жирных кислот в тканях рака молочной железы вызвано аномальной экспрессией ACC и FASN. Поэтому мы проанализировали пространственную экспрессию ACC и FASN в тканях рака молочной железы. Для сопоставления пространственных характеристик жирных кислот и связанных с ними метаболических ферментов мы провели иммунофлуоресцентный (ИФ) анализ на соседних участках тканей. На рис. 5d и е проиллюстрированы ИФ-изображения ACC и FASN в прилегающих участках ткани рака молочной железы. Важно, что ACC и FASN демонстрировали более сильную экспрессию в области рака, чем в прилегающей нормальной области, что хорошо согласуется с пространственными характеристиками пальмитиновой кислоты.

Рисунок 5. (а) Путь биосинтеза жирных кислот. ( b) Гистограмма среза ткани рака молочной железы, окрашенная с помощью H&E. (c) МС изображение ПМК в срезе ткани рака молочной железы. (d-e) Иммунофлуоресцентные изображения АСС и FASN в срезе ткани рака молочной железы, АСС и FASN – красная окраска, синяя – окраска DAPI. АСС – ацетил-КоА карбоксилаза; FASN – синтаза жирных кислот; ПМК – пальмитиновая кислота

Исследование биологических функций ACC и FASN в пролиферации и метастазировании раковых клеток молочной железы

С помощью пространственного МАЛДИ-МСИ и ИФ анализа мы обнаружили, что жирные кислоты и метаболические ферменты, связанные с синтезом жирных кислот, усиленно регулируются в участках рака молочной железы. Далее мы исследовали роль ACC и FASN, двух ключевых ферментов в пути синтеза жирных кислот, в пролиферации и метастазировании клеток рака молочной железы.

Предыдущие исследования показали, что TVB-2640 и PF-05175157 могут подавлять экспрессию FASN и ACC в опухолевых клетках соответственно. В этом исследовании TVB-2640 и PF-05175157 использовали для лечения тройного негативного рака молочной железы человека MDA-MB-231. Чтобы исследовать токсические эффекты TVB-2640 и PF-05175157, мы установили различные концентрации двух ингибиторов для обработки клеток MDA-MB-231. IC50 TVB-2640 и PF-05175157 к клеткам MDA-MB-231 через 24 ч составляла 131,8 мкМ и 428,5 мкМ соответственно. TVB-2640 и PF-05175157 подавляли активность клеток трижды негативного рака молочной железы концентрационно зависимым способом (рис. 6а). Для дальнейшего наблюдения за влиянием двух ингибиторов на клетки MDA-MB-231 эти клетки были разделены на четыре группы, включавшие DMSO, TVB-2640 (100 мкМ), PF-05175157 (300 мкМ) и комбинированную группу. Эксперимент с CCK8 показал, что активность клеток комбинированной группы была значительно ниже, чем в группах с одним ингибитором (рис. 6b). Эксперимент с образованием клонов показал, что количество клеточных колоний в группах с одним ингибитором было значительно ниже, чем в контрольной группе, а количество клеточных колоний в комбинированной группе было еще ниже по сравнению с группами с одним ингибитором (рис. 6с). 5-Этинил-2′-дезоксиуридин (EdU) может заменять тимидин в синтезе ДНК. EdU-488 может отражать пролиферацию клеток, выявляя синтез ДНК. Наши результаты показали, что TVB-2640 и PF-05175157 могут ингибировать синтез ДНК в клетках рака молочной железы по сравнению с контрольной группой, причем эффект комбинированной группы был значительно лучше, чем группы с одним ингибитором (рис. 6d). Кроме того, влияние TVB-2640 и PF-05175157 на клетки MDA-MB-231 было проанализировано путем исследования клеточного ядра с помощью окрашивания DAPI. Результаты показали, что лечение ингибиторами FASN и ACC может вызвать пикноз и фрагментацию ядра (рис. 6e). Через 24 ч ингибиторы FASN и ACC эффективно подавляли миграцию клеток (рис. 6f). Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что TVB-2640 и PF-05175157 могут подавлять пролиферацию и метастазирование клеток MDA-MB231 тройного негативного рака молочной железы в зависимости от концентрации.

Рисунок 6. Влияние ингибиторов ACC и FASN на клетки MDA-MB-231. (a-b) Жизнеспособность клеток определяли с помощью теста CCK-8. (с) Образование колоний оценивали с помощью теста на образование колоний. (d) EdU-488 обнаруживает синтез ДНК в клетках MDA-MB-231. (e) Окраска DAPI отражает изменения в ядре. (f) Миграцию клеток ТОРМЖ количественно оценивали по заживлению ран.

Обсуждение

Метаболическое перепрограммирование было определено визитной карточкой рака. В последние годы метаболическое перепрограммирование жирных кислот в опухолях привлекает все больше внимания. Некоторые исследователи использовали технологию МСВ для характеристики пространственного распределения жирных кислот в высокогетерогенных раках молочной железы, но при этом обнаруживали и визуализировали только жирные кислоты с высоким содержанием, такие как ЖК-18:1, ЖК-20:4, ЖК-22:4 и др. [27, 40]. В этом исследовании, используя BNDM как матрицу МАЛДИ, мы получили МС-изображения 23 жирных кислот в тканях рака молочной железы. Пространственное распределение одной С14 ЖК (ЖК-14:1), трех С16 ЖК (ЖК-16:0, ЖК-16:1, ЖК-16:2), четырех С18 ЖК (ЖК-18:0, ЖК-18:1, ЖК-18:2, ЖК-18:3), шести С20 ЖК (ЖК-20:0, ЖК-20:1, ЖК-20. 2, ЖК-20.3, ЖК-20.4, ЖК-20.5), семь C22 (ЖК-22.0, ЖК-22.1, ЖК-22.2, ЖК-22.3, ЖК-22.4, ЖК-22.5, ЖК-22.6) и два C24 (ЖК-24.0, ЖК-24.1). Насколько нам известно, именно этот метод МСВ обнаруживает наибольшее количество жирных кислот в биологических тканях.

Выявлено, что пространственная экспрессия большинства жирных кислот в участках рака молочной железы значительно выше, чем в парных нормальных участках. Выделив специфические для региона МС-профили жирных кислот в участках рака молочной железы и парных нормальных участках, мы создали гистологически достоверную референс-библиотеку жирных кислот. В сочетании с многомерным статистическим анализом мы создали классификационную модель ОЧНК-ДА, которая может отличить раковые ткани молочной железы от нормальных тканей на основе экспрессии жирных кислот. Без сложного окрашивания тканей и профессиональных патологоанатомов мы можем быстро определить тип ткани, импортируя профили МС жирных кислот неизвестных образцов в режим классификации ОЧНК-ДА. Эта модель продемонстрировала хорошие результаты в идентификации рака молочной железы и нормальных участков с общей точностью 98,2%, обеспечивая новый подход к быстрой диагностике рака молочной железы.

Повышение уровня жирных кислот в раковых тканях молочной железы может быть связано с их метаболическим перепрограммированием для поддержания быстрой пролиферации и энергетического обмена. В процессе биосинтеза жирных кислот сначала производится пальмитиновая кислота (ЖК-16:0), которая затем денатурируется и элонгируется в несколько других типов жирных кислот. ACC и FASN – это два фермента, ограничивающие скорость биосинтеза пальмитиновой кислоты de novo. В этом исследовании с помощью пространственного МАЛДИ-МСВ и иммунофлуоресцентного анализа мы обнаружили, что экспрессия пальмитиновой кислоты, ACC и FASN в тканях рака молочной железы была значительно выше, чем в нормальных тканях. Это свидетельствует о том, что метаболическое перепрограммирование обмена жирных кислот при раке молочной железы происходит как на уровне метаболических ферментов, так и на уровне метаболитов. Сопоставление и корреляция характеристик пространственной экспрессии метаболитов и метаболических ферментов в высокогетерогенных раковых тканях предоставит новые знания для выяснения сложного метаболического перепрограммирования раковых клеток.

Направленное влияние на измененный метаболизм для противоопухолевой терапии широко исследуется. Ингибирование экспрессии FASN в раковых клетках молочной железы может остановить чрезмерную активность синтеза жирных кислот. Собственно, существует большой интерес к разработке ингибиторов FASN для ограничения роста раковых клеток [41, 42]. Несколько FASN-специфических ингибиторов, таких как церуленин [43], C75 [44], орлистат [45] и TVB-2640/3166/3664 [46,47,48], были разработаны для таргетной терапии рака. Таргетирование АСС является еще одним подходом к блокированию синтеза жирных кислот и ограничению роста раковых клеток [14, 49]. Однако есть также сообщения о том, что ингибирование АСС уменьшает окислительный стресс опухолевых клеток и способствует росту солидных опухолей [50]. В этом исследовании мы проверили влияние ингибиторов FASN и АСС на клетки MDA-MB-231 тройного отрицательного рака молочной железы. Препараты TVB-2640 и PF-05175157 являются ингибиторами FASN и ACC соответственно и используются для лечения клеток рака молочной железы. Результаты показывают, что и TVB-2640, и PF-05175157 могут эффективно подавлять клеточную активность, пролиферацию и метастазирование клеток MDA-MB-231. Важно, что мы также обнаружили, что при обработке клеток MDA-MB-231 комбинацией TVB-2640 и PF-05175157 рост, пролиферация и способность к метастазированию раковых клеток значительно снижаются по сравнению с теми, которые получали только TVB-2640 или PF-05175157. Это означает, что подавление нескольких метаболических мишеней рака путем химического ингибирования может иметь лучший эффект для ограничения роста раковых клеток.

Таким образом, мы разработали высокочувствительный метод МАЛДИ-МСВ для характеристики пространственных сигнатур жирных кислот в гетерогенных тканях рака молочной железы. В целом было успешно обнаружено и визуализировано 23 жирные кислоты. Большинство жирных кислот демонстрировали более высокую экспрессию в раковых участках, чем в парных нормальных участках. На основе пространственной экспрессии жирных кислот мы создали классификационную модель ОЧНК-ДА для идентификации рака молочной железы и нормальных тканей, и общая точность прогнозирования достигла 98,2%. Также было обнаружено, что два метаболических фермента, ACC и FASN, которые участвуют в синтезе жирных кислот de novo, аномально гиперактивны в тканях рака молочной железы. Сочетание и корреляция характеристик пространственной экспрессии жирных кислот и ферментов, связанных с синтезом жирных кислот, значительно улучшит наше понимание метаболического перепрограммирования рака молочной железы. Кроме того, мы подтвердили решающую роль FASN и ACC на клетках MDA-MB-231. Подавление экспрессии FASN и ACC может ограничить рост, пролиферацию и метастазирование трижды отрицательных клеток рака молочной железы, а одновременное подавление экспрессии этих двух ферментов намного эффективнее, чем подавление только одного из них. В общем, результаты, полученные в этом исследовании, указывают на то, что жирные кислоты и ферменты, связанные с их синтезом, подверглись значительному метаболическому перепрограммированию при раке молочной железы, и нацеливание на измененный путь биосинтеза жирных кислот является потенциальной стратегией терапии рака молочной железы.

Ссылки на источники

1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A et al. ,. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71:209 – 49
2. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68:394–424.
3. Faubert B, Solmonson A, DeBerardinis RJ. Metabolic reprogramming and cancer progression.Science. 2020;368.
4. Piazza I, Kochanowski K, Cappelletti V, Fuhrer T, Noor E, Sauer U, et al. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of Chemical Communication. Cell. 2018;172:358–72. e23.
5. Sun X, Wang M, Wang M, Yu X, Guo J, Sun T, et al. Metabolic reprogramming in Triple-Negative breast Cancer. Front Oncol. 2020;10:428.
6. Eisenberg L, Eisenberg-Bord M, Eisenberg-Lerner A, Sagi-Eisenberg R. Metabolic alterations in the tumor microenvironment and their role in oncogenesis. Cancer Lett. 2020;484:65–71.
7. Oh S, Kim H, Nam K, Shin I. Glut1 promotes cell proliferation, migration and invasion by regulating epidermal growth factor receptor and integrin signaling in triple-negative breast cancer cells. BMB Rep. 2017;50:132–7.
8. Shen L, O’Shea JM, Kaadige MR, Cunha S, Wilde BR, Cohen AL, et al. Metabolic reprogramming in triple-negative breast cancer through myc suppression of TXNIP. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:5425–30.
9. McCartney A, Vignoli A, Biganzoli L, Love R, Tenori L, Luchinat C, et al. Metabolomics in breast cancer: a decade in review. Cancer Treat Rev. 2018;67:88–96.
10. Masisi BK, El Ansari R, Alfarsi L, Rakha EA, Green AR, Craze ML. The role of glutaminase in cancer. Histopathology. 2020;76:498–508.
11. Cao MD, Lamichhane S, Lundgren S, Bofin A, Fjøsne H, Giskeødegård GF, et al. Metabolic characterization of triple negative breast cancer. BMC Cancer. 2014;14:941.
12. Sun C, Wang F, Zhang Y, Yu J, Wang X. Mass spectrometry imaging-based metabolomics to visualize the spatially resolved reprogramming of carnitine metabolism in breast cancer. Theranostics. 2020;10:7070–82.
13. Madak-Erdogan Z, Band S, Zhao YC, Smith BP, Kulkoyluoglu-Cotul E, Zuo Q, et al. Free fatty acids rewire Cancer metabolism in Obesity-Associated breast Cancer via estrogen receptor and mTOR Signaling. Cancer Res. 2019;79:2494–510.
14. Röhrig F, Schulze A. The multifaceted roles of fatty acid synthesis in cancer. Nat Rev Cancer. 2016;16:732–49.
15. Menendez JA, Lupu R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 2007;7:763–77.
16. van Weverwijk A, Koundouros N, Iravani M, Ashenden M, Gao Q, Poulogiannis G, et al. Metabolic adaptability in metastatic breast cancer by AKR1B10-dependent balancing of glycolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun. 2019;10:2698.
17. Gong Y, Ji P, Yang Y-S, Xie S, Yu T-J, Xiao Y, et al. Metabolic-pathway-based subtyping of Triple-Negative breast Cancer reveals potential therapeutic targets. Cell Metabol. 2021;33:51–64e9.
18. Xu S, Chen T, Dong L, Li T, Xue H, Gao B, et al. Fatty acid synthase promotes breast cancer metastasis by mediating changes in fatty acid metabolism. Oncol Lett. 2021;21:27.
19. Camarda R, Zhou AY, Kohnz RA, Balakrishnan S, Mahieu C, Anderton B, et al. Inhibition of fatty acid oxidation as a therapy for MYC-overexpressing triple-negative breast cancer. Nat Med. 2016;22:427–32.
20. Park J, Shin Y, Kim TH, Kim DH, Lee A. Plasma metabolites as possible biomarkers for diagnosis of breast cancer. PLoS ONE. 2019;14:e0225129.
21. Ouldamer L, Goupille C, Vildé A, Arbion F, Body G, Chevalier S, et al. N-3 polyunsaturated fatty acids of Marine Origin and Multifocality in human breast Cancer. PLoS ONE. 2016;11:e0147148.
22. Norris JL, Caprioli RM. Analysis of tissue specimens by Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization imaging Mass Spectrometry in Biological and Clinical Research. Chem Rev. 2013;113:2309–42.
23. Wu C, Dill AL, Eberlin LS, Cooks RG, Ifa DR. Mass spectrometry imaging under ambient conditions. Mass Spectrom Rev. 2013;32:218–43.
24. Kompauer M, Heiles S, Spengler B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 2017;14:90–6.
25. Aichler M, Walch A. MALDI imaging mass spectrometry: current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 2015;95:422–31.
26. Römpp A, Guenther S, Schober Y, Schulz O, Takats Z, Kummer W, et al. Histology by Mass Spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy Bioanalytical Imaging. Angew Chem Int Ed. 2010;49:3834–8.
27. Guenther S, Muirhead LJ, Speller AV, Golf O, Strittmatter N, Ramakrishnan R, et al. Spatially resolved metabolic phenotyping of breast cancer by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Cancer Res. 2015;75:1828–37.
28. Abbassi-Ghadi N, Antonowicz SS, McKenzie JS, Kumar S, Huang J, Jones EA, et al. De Novo Lipogenesis alters the phospholipidome of esophageal adenocarcinoma. Cancer Res. 2020;80:2764–74.
29. Veselkov KA, Mirnezami R, Strittmatter N, Goldin RD, Kinross J, Speller AV, et al. Chemo-informatic strategy for imaging mass spectrometry-based hyperspectral profiling of lipid signatures in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:1216–21.
30. Sun C, Li T, Song X, Huang L, Zang Q, Xu J, et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116:52–7.
31. Zhang J, Li SQ, Lin JQ, Yu W, Eberlin LS. Mass Spectrometry Imaging enables discrimination of Renal Oncocytoma from Renal Cell Cancer Subtypes and normal kidney tissues. Cancer Res. 2020;80:689–98.
32. Randall EC, Lopez BGC, Peng S, Regan MS, Abdelmoula WM, Basu SS, et al. Localized metabolomic gradients in patient-derived xenograft models of Glioblastoma. Cancer Res. 2020;80:1258–67.
33. Banerjee S, Zare RN, Tibshirani RJ, Kunder CA, Nolley R, Fan R, et al. Diagnosis of prostate cancer by desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging of small metabolites and lipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114:3334–9.
34. Calligaris D, Caragacianu D, Liu X, Norton I, Thompson CJ, Richardson AL, et al. Application of desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging in breast cancer margin analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:15184–9.
35. Eberlin LS, Norton I, Orringer D, Dunn IF, Liu X, Ide JL, et al. Ambient mass spectrometry for the intraoperative molecular diagnosis of human brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:1611–6.
36. Santoro AL, Drummond RD, Silva IT, Ferreira SS, Juliano L, Vendramini PH, et al. In situ DESI-MSI lipidomic profiles of breast Cancer Molecular Subtypes and Precursor Lesions. Cancer Res. 2020;80:1246–57.
37. Mascini NE, Eijkel GB, ter Brugge P, Jonkers J, Wesseling J, Heeren RM. The use of mass spectrometry imaging to predict treatment response of patient-derived xenograft models of triple-negative breast cancer. J Proteome Res. 2015;14:1069–75.
38. Mao X, He J, Li T, Lu Z, Sun J, Meng Y, et al. Application of imaging mass spectrometry for the molecular diagnosis of human breast tumors. Sci Rep. 2016;6:21043.
39. Sun C, Liu W, Mu Y, Wang X. 1,1′-binaphthyl-2,2′-diamine as a novel MALDI matrix to enhance the in situ imaging of metabolic heterogeneity in lung cancer. Talanta. 2020;209:120557.
40. Tata A, Woolman M, Ventura M, Bernards N, Ganguly M, Gribble A, et al. Rapid detection of necrosis in breast Cancer with Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Sci Rep. 2016;6:35374.
41. Luengo A, Gui DY, Vander Heiden MG. Targeting metabolism for Cancer Therapy. Cell Chem Biol. 2017;24:1161–80.
42. Martinez-Outschoorn UE, Peiris-Pages M, Pestell RG, Sotgia F, Lisanti MP. Cancer metabolism: a therapeutic perspective. Nat Rev Clin Oncol. 2017;14:11–31.
43. Menendez JA, Vellon L, Mehmi I, Oza BP, Ropero S, Colomer R, et al. Inhibition of fatty acid synthase (FAS) suppresses HER2/neu (erbB-2) oncogene overexpression in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:10715–20.
44. Zhou W, Simpson PJ, McFadden JM, Townsend CA, Medghalchi SM, Vadlamudi A, et al. Fatty acid synthase inhibition triggers apoptosis during S phase in human cancer cells. Cancer Res. 2003;63:7330–7.
45. Kridel SJ, Axelrod F, Rozenkrantz N, Smith JW. Orlistat is a novel inhibitor of fatty acid synthase with antitumor activity. Cancer Res. 2004;64:2070–5.
46. Heuer TS, Ventura R, Mordec K, Lai J, Fridlib M, Buckley D, et al. FASN Inhibition and Taxane Treatment combine to enhance anti-tumor efficacy in Diverse Xenograft Tumor Models through disruption of Tubulin Palmitoylation and Microtubule Organization and FASN inhibition-mediated Effects on Oncogenic Signaling and Gene expression. EBioMedicine. 2017;16:51–62.
47. O’Farrell M, Duke G, Crowley R, Buckley D, Martins EB, Bhattacharya D, et al. FASN inhibition targets multiple drivers of NASH by reducing steatosis, inflammation and fibrosis in preclinical models. Sci Rep. 2022;12:15661.
48. Ventura R, Mordec K, Waszczuk J, Wang Z, Lai J, Fridlib M et al. Inhibition of de novo Palmitate Synthesis by Fatty Acid Synthase Induces Apoptosis in Tumor Cells by Remodeling Cell Membranes, Inhibiting Signaling Pathways, and Reprogramming Gene Expression. EBioMedicine 2015;2:808 – 24.
49. Beckers A, Organe S, Timmermans L, Scheys K, Peeters A, Brusselmans K, et al. Chemical inhibition of acetyl-CoA carboxylase induces growth arrest and cytotoxicity selectively in cancer cells. Cancer Res. 2007;67:8180–7.
50. Jeon S-M, Chandel NS, Hay N. AMPK regulates NADPH homeostasis to promote tumour cell survival during energy stress. Nature. 2012;485:661–5.