Прогнозирование ранней и поздней преэклампсии на доклинической стадии с помощью плацентарно-специфического профилирования внеклеточной микроРНК

Резюме

Преэклампсия (ПЭ) – одно из тяжелых осложнений беременности, которое встречается в 3-8% случаев и является одной из ведущих причин материнской и перинатальной смертности. Фундаментальная роль в патогенезе ПЭ отводится материнским и/или плацентарным факторам, сочетание и проявление которых определяет время появления клинических симптомов ПЭ (до или после 34 недель гестации) и их выраженность. Известно, что уровень экспрессии МикроРНК – регуляторов сигнальных каскадов в клетке – зависит от срока беременности. В данном исследовании мы сосредоточились на идентификации плацентоспецифических МикроРНК, которые дифференцируют раннюю и позднюю преэклампсию (рПЭ и пПЭ) в течение беременности, с первого по третий триместр. Всего было проанализировано 67 пациенток с помощью глубокого секвенирования малых РНК и количественной ПЦР в реальном времени, что позволило получить основной перечень МикроРНК (let-7b-5p, let-7d-3p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-22-5p, miR-451a, miR-1246, miR-30e-5p, miR-20a-5p, miR-1307-3p и miR-320e), которые в определенных комбинациях могут прогнозировать рПЭ или пПЭ со 100% чувствительностью и 84-100% специфичностью в 1 триместре беременности. По данным литературы, эти микроРНК-предикторы ПЭ контролируют пролиферацию трофобласта, инвазию, миграцию, синцитиализацию, развернутый белковый ответ эндоплазматического ретикулума, иммунную толерантность, ангиогенез и целостность сосудов. Одновременное выявление let-7d-3p, miR-451a и miR-1307-3p, устойчивых к многократному замораживанию/оттаиванию образцов сыворотки крови, в сочетании с биохимическими (b-ХГЧ и Протеин-А плазмы, ассоциированный с беременностью PAPP-A) и ультразвуковыми (ИПМА) показателями позволило разработать универсальную модель для прогнозирования возникновения рПЭ и пПЭ (ЛПУ = 15. 7% и ЛОУ = 9,5%), которая была валидизирована на тестовой когорте из 48 пациентов и продемонстрировала ложноположительные результаты в 26,7% случаев и ложноотрицательные в 5,6% случаев. Для сравнения, использование общепринятой программы Astraia в анализе тестовой когорты пациентов привело к худшим результатам: ЛПУ = 62,1% и ЛОУ = 33,3%.

Ключевые слова:  ранняя преэклампсия; поздняя преэклампсия; микроРНК; глубокое секвенирование малых РНК; количественная ПЦР в реальном времени; плацента; сыворотка крови; первый триместр

1. Вступление

Преэклампсия (ПЭ) является мультисистемным осложнением 3-8% всех беременностей [1], на которое приходится 16-18% материнских и 40% фетальных и неонатальных смертей [2]. По определению Международного общества по изучению гипертензии у беременных (ISSHP), ПЭ определяется как гипертензия de novo (артериальное давление выше 140/90 мм рт.ст.) после 20 недель беременности, сопровождающаяся протеинурией (не менее 0,3 г/л в сутки) или признаками острой почечной недостаточности, нарушением функции печени, неврологическими расстройствами, гемолизом, тромбоцитопенией или внутриутробной задержкой роста. ПЭ может быть ранней (рПЭ) или поздней (пПЭ), в зависимости от времени появления клинических симптомов (до или после 34-й недели беременности соответственно) [3]. Кроме того, рПЭ характеризуется более тяжелым течением и составляет 5-20% от всех видов ПЭ. Неблагоприятные последствия для плода связаны с хронической гипоксией и высокой частотой задержки развития, а также вызывают осложнения у плода вследствие недоношенности, включая респираторный дистресс-синдром, инфекционные и воспалительные заболевания, внутрижелудочковые кровоизлияния, церебральный паралич, когнитивную задержку, аутизм, психомоторные и поведенческие расстройства и/или нарушение способности к обучению [4,5].

Материнские и/или плацентарные факторы играют фундаментальную роль в патогенезе ПЭ, что определяет время начала клинических проявлений и их тяжесть. Нарушение пролиферации и дифференцировки клеток трофобласта на преимплантационном этапе в случае нарушений в эмбриональном периоде, а также на последующих этапах имплантации вследствие воспалительных изменений в децидуальной оболочке могут влиять на взаимодействие клеток трофобласта и эндометрия и дальнейший плацентогенез [6,7,8]. Нарушение дифференцировки клеток вневорсинчатого трофобласта приводит к недостаточному ремоделированию спиральных маточных артерий: сначала это происходит в децидуальном сегменте до 10-й недели беременности в виде снижения артериальной обструкции через эндоваскулярные клетки трофобласта и, как следствие, повреждения ворсин плаценты активными формами кислорода и азота [9], а затем – в сегментах миометрия с 16-й по 18-ю неделю беременности [10]. ], а затем – в сегментах миометрия с 16-й по 18-ю неделю беременности [10]. Результатом аномальной перестройки маточных артерий является повышение их сопротивления и механическое повреждение ворсин плаценты из-за повышения кровяного давления, попадающего в межворсинчатое пространство [11,12,13,14]. Возникает нарушение маточно-плацентарного кровотока, что приводит к гипоксическим/ишемическим изменениям в ткани плаценты [1,15]. Из ишемизированной плаценты высвобождаются различные биологические факторы, вызывающие системное повреждение эндотелия сосудов и возникновение острой полиорганной недостаточности у матери. Снижение концентрации циркулирующих плацентарных факторов, таких как ассоциированный с беременностью плазменный белок А (PAPP-A) и плацентарный фактор роста (PlGF), а также увеличение образования растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1, уровни сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGF-A), ингибина А, актина А, прокоагулянта Р-селектина, провоспалительного интерлейкина 2 и фактора некроза опухолей альфа, ассоциируются с ПЭ [1,16,17,18]. Материнские патогенетические факторы включают генетическую предрасположенность, иммунологические факторы, метаболический синдром и сахарный диабет; хроническая артериальная гипертензия может усилить восприимчивость матери к факторам, выделяемым ишемизированной плацентарной тканью, и ускорить появление клинических симптомов у матери [19].

Учитывая роль эпигенетических механизмов, регулирующих дифференциацию, миграцию и инвазию клеток трофобласта [20], одним из основных компонентов которых являются малые некодирующие РНК (мнкРНК), были проведены многочисленные исследования с целью оценки качественного и количественного состава микроРНК у женщин с ПЭ по сравнению с физиологической беременностью. микроРНК – это небольшие (около 20-24 нуклеотидов длиной) одноцепочечные молекулы, которые снижают экспрессию генов на посттранскрипционном уровне путем дестабилизации мРНК и/или угнетения трансляции белка. Во время беременности микроРНК могут контролировать инвазию и миграцию клеток трофобласта и ангиогенез, в частности, регулируя уровни экспрессии VEGF, sFlt-1 и HIF-1α [21,22]. В плаценте и периферической крови беременных с ПЭ выявлены специфические паттерны экспрессии микроРНК [23,24]. Winger E. и соавт. проанализировали прогностический потенциал уровней экспрессии 30 микроРНК в лейкоцитах периферической крови женщин для прогнозирования развития ПЭ в 1-м триместре беременности с помощью количественной ПЦР [25]. Кроме того, был проанализирован состав микроРНК в плазме крови беременных женщин и выявлено, что треть из 368 идентифицированных микроРНК не была упакована в экзосомы; только 8 экзосомных микроРНК (miR-134, miR-196b, miR-302c, miR-346, miR-376c, miR-486-3p, miR-590-5p и miR-618) достоверно отличались при ПЭ от физиологической беременности на момент родов, и из них только 4 микроРНК (miR-134, miR-376c, miR-486-3p и miR-590-5p) прогнозировали развитие ПЭ в 1 триместре беременности [26]. Громадникова И. и коллеги оценили потенциал miR-516b-5p, miR-517-5p, miR-518b, miR-520a-5p, miR-520h и miR-525-5p в экзосомах плазмы крови беременных для прогнозирования ПЭ и гестационной гипертензии во время скрининга в первом триместре беременности [27]. Caterina Licini обнаружила ранний циркулирующий биомаркер ПЭ-miR-125b, который нацелен на поверхностный антиген клеток трофобласта ((Trop)-2) и участвует в регуляции межклеточной адгезии и клеточной пролиферации [28].

Несмотря на выявленную прогностическую значимость определенных микроРНК в диагностике развития ПЭ на доклинической стадии, последние исследования были посвящены только пПЭ, но не рПЭ, которая характеризуется более тяжелым течением с неблагоприятными материнскими и перинатальными последствиями. В связи с вышеизложенным, целью данного исследования было выявление тканево-специфических молекул микроРНК плаценты, имеющих прогностическое значение в оценке вероятности развития рПЭ и пПЭ, путем анализа сыворотки крови женщин в сроке 11-14 недель гестации методом глубокого секвенирования с последующей валидацией с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

2. Результаты

2.1. Поиск плацентоспецифической внеклеточной микроРНК в рПЭ и пПЭ во время родов

На первом этапе исследования в первой когорте пациенток (табл. 1) были проанализированы микроРНК, которые дифференцируют рПЭ от пПЭ по профилю экспрессии в плаценте и плазме периферической крови пациенток на момент родов. Группу сравнения для анализа рПЭ составили пациентки, которые рожали до 34 г (N < 34) из-за отсутствия возможности пролонгирования беременности. В группу сравнения для анализа пПЭ вошли пациентки с физиологическим течением беременности (N > 34). Учитывая возможное влияние различных осложнений беременности, приводящих к ее прерыванию, на профиль микроРНК, мы провели тщательный отбор пациенток для формирования контрольной группы: “N < 34”. В группу “N < 34” для анализа плаценты и плазмы периферической крови беременных с рПЭ вошли пациентки с нормальными данными скрининга 1-го и 2-го триместра беременности, нормальными показателями фето-плацентарного и маточно-плацентарного кровотока, но ургентным родоразрешением в сроке 25-32 недели в связи с истончением рубца на матке до 1-1. 2 мм по данным УЗИ (глубокого дефекта в области рубца не определялось) после предыдущих 1-3 кесаревых сечений, в сочетании с истмико-цервикальной недостаточностью или без нее и началом регулярной родовой деятельности; с данными клинико-лабораторных методов исследования, которые были в пределах нормы; с неповрежденными плодными оболочками во время родов, при этом отошедшие околоплодные воды были светлыми, а признаков хориоамнионита не наблюдалось. Ни у одной пациентки из группы “N < 34” не было выявлено патологических изменений морфологической структуры плаценты. Однако, при сравнении данных секвенирования микроРНК в ткани плаценты в исследуемых группах мы обнаружили статистически значимые различия в 305 из 577 идентифицированных микроРНК в плаценте что точно указывает на гестационные изменения экспрессии микроРНК, подчеркивая важность сравнения группы рПЭ или пПЭ с исследуемыми группами. В то же время, при сравнении данных секвенирования микроРНК в плазме крови женщин из контрольных групп (N > 34 против N < 34) не было выявлено статистически значимых изменений в содержании какой-либо микроРНК.

Таблица 1 Клинические характеристики первой когорты пациентов.

Примечание: * – все данные приведены как средние значения (минимум; максимум).

Профилирование микроРНК в ткани плаценты и плазме периферической крови пациенток проанализированных групп проводили с помощью NGS. При сравнении списков дифференцированно экспрессированных микроРНК в ткани плаценты женщин с рПЭ и пПЭ, их интерсекция была или отсутствовала в случае микроРНК, которая проявляет большую активность (Рисунок 1А), или была минимальной в случае микроРНК, которая проявляет меньшую активность (Рисунок 1B). Важно отметить, что подавляющее большинство микроРНК, ассоциированных с рПЭ или пПЭ, имеющихся в материнском кровообращении, являются плацентарно-специфическими и представлены в пониженном уровне (Рисунок 1C и 1D, соответственно). Более того, в случае рПЭ не было обнаружено ни одного повышенного уровня микроРНК в плазме крови (Рисунок 1C), тогда как в случае пПЭ 10 микроРНК были повышенными, и из них 4 микроРНК были плацентарного происхождения (Рисунок 1D). Важным результатом данного исследования является наличие разнонаправленных изменений уровня экспрессии большинства микроРНК при рПЭ и пПЭ в ткани плаценты (Рисунок 1E): 186 микроРНК (список 1) были повышены в рПЭ и снижены в пПЭ, тогда как 103 микроРНК (список 2) были снижены в рПЭ и повышены в пПЭ. Полученные результаты отражают патогенетические различия между рПЭ и пПЭ на молекулярном уровне. Поэтому нам показалось интересным проанализировать сигнальные пути, на которые влияют эти микроРНК с разнонаправленными изменениями уровней экспрессии. С помощью алгоритма Funrich “обогащение микроРНК” было выявлено 74 сигнальных пути-мишени, которые являются общими для двух списков микроРНК (Рисунок 1E), но белковые продукты генов-мишеней этих микроРНК отличаются, формирующие каждый из 74 сигнальных путей, были либо одинаковыми, либо разными для микроРНК из списка 1 и списка 2, как показано для “сигнальных событий CDC42”, сигнальных событий Arf6, сигнальных сетей VEGF и VEGFR, сигнального пути TRAIL и пути Glypican. То есть микроРНК разных типов из списков 1 и 2, благодаря различной направленности изменений уровня экспрессии при раннем ПЭ или позднем ПЭ, имеют противоположные эффекты на гены-мишени одного и того же сигнального пути, активность которых зависит от преобладающего эффекта каждой микроРНК. Кроме того, было идентифицировано 14 сигнальных путей, которые регулируются только микроРНК из Списка 1, но не из Списка 2 (в частности, эпителиально-мезенхимальный переход, сигнальный путь Wnt и неканонический сигнальный путь), а также 15 сигнальных путей, регулируемых микроРНК только из Списка 2, но не из Списка 1 (в частности, путь EphrinB-EPHB, путь EphrinA-EPHA, факторы, участвующие в развитии мегакариоцитов и производстве тромбоцитов, а также сигнальный путь EPO). Очевидно, что различия в патогенезе рПЭ и пПЭ усугубляются наличием дифференцированно экспрессируемых микроРНК, специфичных для 1 из 2 форм ПЭ: 46 восходящих и 33 нисходящих микроРНК для рПЭ и 38 нисходящих и 14 восходящих микроРНК для пПЭ (Рисунок 1E).

Рисунок 1. Сравнение дифференцированной экспрессии микроРНК в плаценте и плазме крови беременных с рПЭ и пПЭ на момент родов с помощью построения диаграмм Венна-Эйлера и анализа регулируемых ими сигнальных путей в программе Funrich. (А) Поиск пересечения списков значительно повышенной активности микроРНК в плаценте женщин с рПЭ и пПЭ. (B) Поиск пересечения списков значительно сниженных регуляторных микроРНК в плаценте женщин с рПЭ и пПЭ. (C) Поиск пересечений списков дифференцированно экспрессированных микроРНК в плаценте и плазме крови женщин с рПЭ. (D) Поиск пересечений списков дифференцированно экспрессированных микроРНК в плаценте и плазме крови женщин с пПЭ. (E) Сигнальные пути, регулируемые микроРНК, с разнонаправленными изменениями уровней экспрессии в ткани плаценты у женщин с рПЭ и пПЭ.

Учитывая величину изменений в функционировании сигнальных путей с несбалансированной экспрессией влияющих на них микроРНК при ранней и поздней ПЭ, очевидно, что невозможно искать различия в патогенезе двух форм преэклампсии, анализируя какой-то один сигнальный путь. Подсказкой к возможности каскадных изменений активности сигнальных путей в плаценте является изменение содержания плацентоспецифической микроРНК в плазме крови беременных. Кроме того, важным является поиск микроРНК, ассоциированных с рПЭ и пПЭ, дифференцированно экспрессированных как на доклинической стадии манифестации заболевания, так и на момент родоразрешения по сравнению с неосложненным течением беременности. Поэтому следующим этапом нашего исследования было сравнение полученных профилей экспрессии микроРНК в плаценте и плазме крови на момент родоразрешения с таковыми в сыворотке крови женщин в первом триместре беременности.

2.2. Ретроспективный анализ профиля экспрессии микроРНК в сыворотке крови женщин в первом триместре беременности

Ретроспективный анализ профилей экспрессии микроРНК в сыворотке крови второй когорты из 40 пациенток в возрасте от 27 до 40 лет на 11-14 ГН после получения информации о клиническом диагнозе во время родов (таблица 2) был проведен методом глубокого секвенирования с целью выявления микроРНК, ассоциированных с развитием рПЭ и пПЭ на доклинической стадии. Было сформировано четыре группы пациенток: (1) десять женщин с низким риском развития ПЭ (по программе Astraia) и физиологическим течением доношенной беременности (N); (2) девять женщин с высоким соотношением sFLT-1/PLGF во II и III триместрах доношенной беременности без признаков ПЭ (Nhr) (3) десять женщин с манифестацией ПЭ на 34-37 ГН (пПЭ); и (4) одиннадцать женщин с манифестацией ПЭ в двадцать пять-тридцать три ГН (рПЭ).

Таблица 2 Клинические характеристики второй когорты пациенток, обследованных в первом триместре беременности.

С помощью программы Deseq было выявлено статистически значимое повышение уровней экспрессии hsa-miR-16-5p (p = 0,00048) и hsa-miR-125b-5p (p = 0,01674) в группе рПЭ относительно группы N, а в группе пПЭ относительно группы N наблюдалось повышение уровней hsa-miR-221-3p (p = 0. 00009), hsa-miR-146a-5p (p = 0,00024), hsa-miR-222-3p (p = 0,00075), hsa-miR-21-5p (p = 0,00162), hsa-miR-199a-3p (p = 0,00464), hsa-miR-199b-3p (p = 0,00481), hsa-miR-199a-5p (p = 0. 00585), hsa-miR-30c-5p (p = 0,02807) и hsa-miR-29a-3p (p = 0,03146), а также снижение уровня hsa-miR-1292-5p (p = 0,01780). Из-за небольшого количества микроРНК, которые достоверно отличали ПЭ от N, и отсутствия пересечения между списками дифференцированно экспрессированных микроРНК в рПЭ и пПЭ, мы считали нецелесообразным строить логистические регрессионные модели на основе содержания этих молекул в сыворотке крови с целью оценки их прогностической значимости в генезе ПЭ. Более того, желательно, чтобы эти микроРНК были плацентоспецифическими, то есть дисбаланс в экспрессии отражал нарушение активности сигнальных путей в плаценте, приводящих к развитию рПЭ или пПЭ. Если найти общий перечень микроРНК, которые участвуют в патогенезе как рПЭ, так и пПЭ, но имеют разный вклад в дальнейшее возникновение клинических проявлений ПЭ, то технически будет легче проводить диагностический тест. С этой целью был оценен вклад каждой идентифицированной микроРНК в разделение образцов по наличию или отсутствию рПЭ (Рисунок 2А) и пПЭ (Рисунок 2B) с помощью частичной регрессии по методу наименьших квадратов (МНК).

Рисунок 2. PLS-анализ данных NGS по количеству считываний микроРНК в образцах сыворотки крови пациенток второй когорты. (А) Расположение образцов сыворотки крови женщин с рПЭ и без ПЭ (N). (В) Расположение образцов сыворотки крови женщин с пПЭ и без ПЭ (N).

На рисунке 2А,В можно увидеть расположение образцов с образованием четко пространственно обособленных кластеров, обозначенных черными символами (норма) и красными символами (преэклампсия), где наибольший вклад в это разделение имеют микроРНК с важностью варианта (элемента) (VIP) > 1. Следует отметить, что некоторые из микроРНК показали статистически значимые корреляции их содержания в сыворотке крови беременных женщин со средними уровнями артериального давления, β-ХГЧ, ЛПВП и индексом пульсации маточных артерий по данным скрининга первого триместра беременности (табл. 3 и табл. 4).

Таблица 3 Корреляционный анализ уровней микроРНК сыворотки крови со средним артериальным давлением у беременных в первом триместре с помощью непараметрического метода Спирмена и привлечения генов-мишеней микроРНК к патогенезу различных заболеваний по данным базы данных miRWalk.

Таблица 4. Данные непараметрического корреляционного анализа Спирмена между уровнями микроРНК в сыворотке крови и клинико-лабораторными данными скрининга первого триместра беременности, а также участие генов-мишеней микроРНК в патогенезе различных заболеваний по данным базы данных miRWalk.

 Поиск взаимодействий между микроРНК и генами, ассоциированными с тем или иным заболеванием (данные получены из Alliance of Genome Resources), проводили с помощью базы данных miRWalk (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/diseases/ (дата обращения 28 января 2023 г.)). Мы обнаружили, что большинство микроРНК, которые коррелируют со средним уровнем артериального давления у беременных, влияют на экспрессию генов-мишеней, вовлеченных в возникновение эссенциальной гипертензии, реноваскулярной гипертензии и преэклампсии (табл. 3).

В таблице 4 показано, что микроРНК, которые коррелируют с ИПМА, b-ХГЧ и PAPP-A, могут изменять экспрессию генов-мишеней, участвующих в возникновении сосудистых заболеваний, плацентарной недостаточности и преэклампсии, согласно данным базы данных miRWalk. Для дальнейшего рассмотрения только плацентарно-специфических микроРНК среди молекул была построена диаграмма Венна-Эйлера (Рисунок 3) и определены точки пересечения следующих перечней микроРНК: “дифференцированно экспрессированные микроРНК в плаценте пациенток с рПЭ во время родов”, “циркулирующие микроРНК, ассоциированные с рПЭ при 11-14 ГН”, “дифференцированная экспрессия микроРНК в плаценте пациенток с пПЭ во время родов” и “циркулирующая микроРНК, ассоциированная с пПЭ при весе 11-14 ГН”.

Рисунок 3. Диаграмма Венна-Эйлера циркулирующей микроРНК, ассоциированной с ПЭ на 11-14 ГН и дифференцированно экспрессированной микроРНК в плаценте пациенток с ПЭ во время родов.

На рисунке 3 На рисунке 3 показано, что все микроРНК, которые циркулируют в крови и ассоциируются с рПЭ на 11-14 ГН, являются специфическими для плаценты. Среди циркулирующих микроРНК, ассоциированных с пПЭ на 11-14 ТГ, большинство являются плацентарно-специфическими, но остальные 23 из 249 микроРНК имеют неплацентарное происхождение. Всего 137 плацентарно-специфических микроРНК, идентифицированных в сыворотке крови в первом триместре беременности и ассоциированных с рПЭ и пПЭ (выделены красным цветом на рисунке 3), были рассмотрены для дальнейшего анализа. С помощью скрипта, написанного в R-системе для разработки логистических регрессионных моделей, были проанализированы различные комбинации 137 микроРНК, содержание которых в сыворотке крови на 11-14 неделе гестации идентифицирует пациенток с высоким риском развития рПЭ и пПЭ по данным NGS. Различные комбинации 4 микроРНК с высокой прогностической ценностью (AUC = 1).

Данные NGS были валидированы с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием cel-39 (Qiagen) в качестве референтной РНК. Мы отобрали 17 микроРНК (let-7b-5p, miR-451a, miR-320a-3p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-20a-5p, miR-30e-5p, miR-22-5p, miR-320e, let-7d-3p, miR-146b-5p, miR-148a-3p, miR-519a-3p, miR-99a-5p, miR-1307-3p, miR-26a-5p и miR-1246), которые в различных комбинациях прогнозируют развитие как рПЭ, так и пПЭ. На основе полученных данных qPCR (значение -∆Ct), были разработаны логистические регрессионные модели для прогнозирования рПЭ (Рисунок 4А) и пПЭ (Рисунок 4B), сравнивая их с выборками из групп N и Nhr. Объединение двух нормальных групп (N и Nhr) в группу сравнения было необходимо для рассмотрения случаев, когда риск ПЭ по соотношению sFLT/PLGF был высоким, но клинические признаки ПЭ не начинались до родов. 

Рисунок 4. Логистические регрессионные модели для прогнозирования рПЭ (А) и пПЭ (B) в первом триместре беременности по профилям микроРНК в сыворотке крови пациенток. Количественные данные ЗТ-ПЦР.

Первые три комбинации микроРНК, использованные для построения логистических регрессионных моделей, приведены на вкладке Рисунок 4А, были способны прогнозировать развитие рПЭ в 1-м триместре беременности (p < 0,00001, порог = 0,5) со 100% чувствительностью и 100% специфичностью. Наилучшую прогностическую ценность в оценке вероятности развития рПЭ в 1 триместре беременности обеспечило комбинированное выявление let-7i-5p, miR-320e, miR-519a-3p, miR-1307-3p и miR-17-5p (84% специфичность, 100% чувствительность, p < 0. 0001, порог = 0,159) или комбинации miR-451a, let-7i-5p, miR-320e, miR-519a-3p и miR-17-5p (95% специфичность, 100% чувствительность, p < 0,00001, порог = 0,4628) в моделях логистической регрессии на рисунке 4B, то есть, пПЭ было гипердиагностировано в 16% или 5% случаев соответственно, тогда как ни одного случая пПЭ не было пропущено (ЛОУ = 0).

Для оценки прогностической значимости биохимических показателей (b-ХГЧ, b-ХГЧ (MoM), PAPP-A, PAPP-A (MoM)), данных УЗИ плода (теменно-копчиковый размер, ТКР), толщины шейной складки плода (ТШСП), индекса пульсации маточных артерий (ИПМА), ИПМА (MoM), и среднего артериального давления (САД, МоМ) во время скрининга в первом триместре, были разработаны логистические регрессионные модели для прогнозирования вероятности возникновения рПЭ (Рисунок 5А) и пПЭ (Рисунок 5B) при анализе второй когорты пациенток.

Рисунок 5. Логистические регрессионные модели для прогнозирования ранней ПЭ (А) и поздней ПЭ (В) в первом триместре беременности по биохимическим и ультразвуковым данным.

Наилучшей моделью для прогнозирования рПЭ и пПЭ в 1-м триместре беременности с самым низким процентом пропущенных случаев ПЭ (ЛОУ = 5.3% и ЛОУ = 21% соответственно) оказалось комбинированное определение САД(МоМ) и b-ХГЧ (МоМ), что приводило к ложноположительным результатам в 27,3% и 20% случаев при диагностике рПЭ и пПЭ соответственно. Комбинированное определение САД (МоМ), ИПМА (МоМ), b-ХГЧ (МоМ) и PAPP-A (МоМ) уменьшило гипердиагностику рПЭ (ЛПУ = 18,2%) и пПЭ (ЛПУ = 10,0%), но увеличило количество случаев пропущенной ЭТ (ЛОУ = 10,5% и ЛОУ = 31,6%, соответственно).

В случае использования количественного анализа микроРНК в сыворотке крови (Рисунок 4А,В) как потенциального дополнительного метода прогнозирования развития ПЭ у женщин, которые проходят биохимическое и ультразвуковое обследование в рамках скрининга первого триместра, необходимо уменьшить количество микроРНК, которые образуют комбинацию в разработанных логистических регрессионных моделях, для снижения стоимости комплексного исследования. Кроме того, нормализация количественных данных RT-PCR для каждой микроРНК к внешнему контролю cel-39 (Qiagen) не учитывает возможную деградацию РНК до этапа ее выделения из биологического образца, поскольку она вносится в образец на этапе фенольной экстракции. Для количественного определения микроРНК лучше использовать эндогенный контроль. Кроме того, для упрощения процедуры тестирования образцов необходима логистическая регрессионная модель, одинаковая для прогнозирования как рПЭ, так и пПЭ. Поэтому было решено, как альтернативный вариант, построить логистическую регрессионную модель с привлечением биохимических и ультразвуковых параметров и добавить к этой модели две-три молекулы микроРНК для улучшения ее характеристик. miR-451a, let-7d-3p и miR-1307-3p были выбраны для этой цели по двум основным причинам: их участие в логистических регрессионных моделях для прогнозирования рПЭ и пПЭ и отсутствие снижения их концентрации в образце сыворотки крови во время двойных циклов замораживания/оттаивания, в отличие от других микроРНК. Концентрация miR-451a, let-7d-3p и miR-1307-3p в образцах сыворотки крови не уменьшалась во время двойного замораживания/оттаивания, вероятно, из-за их способности упаковываться в экзосомы, что мы продемонстрировали с помощью глубокого секвенирования малых некодирующих РНК с экзосом, полученных путем культивирования мезенхимальных стромальных клеток человека (54825 считываний для miR-451a и 6707 считываний для let-7d-3p, неопубликованные данные) и индукции плюрипотентных стволовых клеток человека, дифференцирующихся в глиальном направлении (643 считывания для miR-451a и 243 считывания для miR-1307-3p). Сейчас продолжается работа над секвенированием малых некодирующих РНК с экзосом сыворотки крови пациентов когорты 2 этого исследования с целью выявления стабильных микроРНК, которые имеют прогностическое значение для раннего и позднего возникновения ПЭ. Полученные данные будут опубликованы в ближайшее время. Кроме того, было продемонстрировано, что в различных биологических жидкостях, включая сыворотку крови, стабильность микроРНК варьировала в широких пределах, с периодами полураспада от 1,5 ч до более 13 ч, и положительно коррелировала с содержанием GC в последовательности [30]. Количественное определение miR-451a и let-7d-3p проводили относительно содержания miR-1307-3p в образце, рассчитывая ∆Ct = Ct (miR-451a) – Ct(miR-1307-3p) и ∆Ct = Ct (let-7d-3p) – Ct(miR-1307-3p), поскольку наибольший процент GC в последовательности микроРНК был у miR-1307-3p (73%) по сравнению с miR-451a (36%) и let-7d-3p (50%), согласно данным miRBase. Логистические регрессионные модели, разработанные для прогнозирования ПЭ (рПЭ и пПЭ) при сочетании биохимических и ультразвуковых параметров и уровней miR-451a, let-7d-3p и miR-1307-3p, приведены на рисунке 6.

Рисунок 6. Логистические регрессионные модели для прогнозирования ПЭ в первом триместре беременности по биохимическим, ультразвуковым показателям и уровню микроРНК. (А) Модели на основе комбинации биохимических, ультразвуковых показателей и уровня микроРНК. (B) Сравнение двух моделей, основанных на биохимических/УЗИ параметрах с набором данных об уровне микроРНК или без него.

Лучшей моделью для прогнозирования ПЭ в 1 триместре беременности с самым низким процентом пропущенных клинических случаев ПЭ (ЛОУ = 9,5 %) и самым низким процентом ложноположительных результатов (ЛПУ = 15,7 %) оказалось комбинированное определение miR-451a, let-7d-3p, miR-1307-3p, ИПМА, ИПМА(MoM), b-ХГЧ(MoM) и PAPPA(MoM) (Модель 1 на Рисунок 6А). На Рисунок 6B модель 1 с Рисунок 6А дополнительно сравнивается с моделью 2, разработанной с использованием только биохимических и ультразвуковых параметров, с указанием формул для расчета вероятности возникновения ПЭ для обеих моделей.Рисунок 6B демонстрирует, что Модель 2, которая использует только биохимические и ультразвуковые параметры, уступает Модели 1, которая использует количественное определение miR-451a, let-7d-3p и miR-1307-3p в сочетании с биохимическими и ультразвуковыми параметрами (ЛОУ = 14,3% против ЛОУ = 9,5% и ЛПУ = 36,8% против ЛПУ = 15,7% для Модели 2 по сравнению с Моделью 1).

2.3. Апробация разработанной модели прогнозирования ПЭ в І триместре беременности на независимой когорте пациенток

На следующем этапе нашего исследования была использована третья когорта из 48 женщин, которые проходили скрининг беременности в 1 триместре, для получения тестового набора данных и оценки качества разработанной Модели 1 с Рисунок 6B, полученной с помощью тренировочного набора данных от 2-й когорты из 40 пациенток. Полученные результаты были обобщены в виде таблицы 5, которая также включает результаты расчета вероятности ПЭ по программе Astraia (https://astraia.ru/ (дата обращения: 1 декабря 2022 г.)) и модели 2 их Рисунок 6В. Как правило, при использовании программы Astraia частота выявления рПЭ составляла 93,9%, пПЭ – 45,6%, а количество ложноположительных результатов – 10,9%.

Таблица 5. Расчет вероятности возникновения ПЭ по алгоритму программы Astraia и по формулам моделей 1 и 2 Рисунок 6В на примере тестовой когорты беременных, проходивших скрининг в первом триместре.

* ND – невизначене значення.

При сравнении диагноза на момент родов и установленного риска ПЭ в 1-м триместре беременности у пациенток 3-й когорты мы обнаружили, что разработанная формула на основе miR-451a, let-7d-3p, miR-1307-3p, b-hCG(MoM), и уровнях сывороточного АПФР(MoM) и ИПМА и ИПМА(MoM) имела лучшую прогностическую ценность, чем на основе программы Astraia, а именно, количество ложноположительных и ложноотрицательных случаев было значительно меньше при использовании Модели 1 Рисунок 6Б по сравнению с программой Astraia (ЛПУ: 26. 7 % против 62,1 %, ЛОУ: 5,6 % против 33,3 %). Следует отметить, что в 4 из 48 случаев было недостаточно данных для расчета вероятности ПЭ с помощью программы Astraia. В свою очередь, при сравнении двух моделей (Модель 1 против Модели 2 с Рис. 6В) на основе биохимических/ультразвуковых параметров с набором данных об уровне микроРНК или без него, мы подтвердили более точную прогностическую ценность Модели 1, в частности, с ЛПУ = 26,7 % против ЛПУ = 62,0 % и ЛОУ = 5,6 % против ЛОУ = 22,2 % (Табл. 5).

Поэтому вопрос дальнейшей оптимизации модели прогнозирования ПЭ на основе молекулярно-биологических, биохимических и инструментальных методов исследования в первом триместре беременности остается актуальным. Одним из потенциальных кандидатов в качестве дополнительного параметра для модели 1 на Рисунок 6 является секреторный кластерин. Согласно нашему недавнему исследованию [31], разработанные логистические регрессионные модели на основе уровня секреторного кластерина в экстравезикулярной фракции сыворотки крови беременных первого триместра имеют прогностическую значимость в оценке вероятности наступления рПЭ (AUC = 0,97, Se = 1, Sp = 0,875, срез = 0,3877) и пПЭ (AUC = 1, Se = 1, Sp = 1, срез = 0,5).

Сигнальные пути, потенциально регулируемые микроРНК-предикторами ПЭ, идентифицированными в этом исследовании (Рисунок 4), были проанализированы с помощью программы FunRich (Рисунок 7). Среди них были сигнальные пути с доказанной ролью в патогенезе ПЭ, а именно: сигнальные пути ErbB, EGFR, IGF1, PDGF, TRAIL, mTOR, а также те, которые опосредованы действием фокальной контактной киназы и активатора плазминогена урокиназного типа (Рисунок 7). Кроме того, белковые продукты генов-мишеней идентифицированных микроРНК-предикторов ПЭ были преимущественно регуляторами активности транскрипционного фактора, серин-треонин киназы и убиквитин-специфической протеазы.

Рисунок 7. Анализ сигнальных путей, на которые влияют микроРНК-предикторы рПЭ и пПЭ в первом триместре беременности.

3. Обсуждение

Поиск маркеров для прогнозирования ПЭ в первом триместре беременности все еще продолжается из-за отсутствия специфического клинически значимого теста, используемого в рутинной практике. Выявление таких маркеров осложняется различиями в этиопатогенезе различных форм ПЭ, которые определяют раннее или позднее начало клинических проявлений ПЭ после 20-й недели беременности. Еще в 2008 году B. Huppertz выдвинул гипотезу о патофизиологических механизмах ПЭ, в основе которых лежит нарушение дифференцировки между клетками ворсинчатого и/или экстравилезного трофобласта [6], где дисфункция двух основных типов клеток трофобласта приводит к возникновению ПЭ в сочетании с задержкой развития плода, что характерно для ранней формы ПЭ. При наложении влияния материнских факторов, таких как генетическая предрасположенность, иммунологические факторы, метаболический синдром, сахарный диабет, хроническая артериальная гипертензия, увеличивается частота возникновения клинических проявлений ПЭ [19].

В плаценте человека экспрессируются различные типы микроРНК, в частности, специфические для трофобласта [32,33,34]. Дисбаланс экспрессии мнкРНК в плаценте на ранних сроках беременности может играть решающую роль в нарушении плацентации. В наших предыдущих исследованиях мы продемонстрировали связь между профилем эмбрионального секретома, а именно sncRNA, и его имплантационным потенциалом [35,36,37]. Для отслеживания этих нарушений необходим анализ плацентарно-специфических мнкРНК в материнской крови.

В этом исследовании мы продемонстрировали высокую прогностическую ценность различных комбинаций let-7b-5p, miR-451a, miR-320a-3p, let-7f-5p, let-7i-5p, miR-20a-5p, miR-30e-5p, miR-22-5p, miR-320e, let-7d-3p, miR-146b-5p, miR-148a-3p, miR-519a-3p, miR-99a-5p, miR-1307-3p, miR-26a-5p и miR-1246; по их содержанию в сыворотке крови женщин в 1 триместре беременности можно с высокой специфичностью и чувствительностью оценить вероятность развития клинических симптомов ранней или поздней ПЭ после 20 недель беременности (Рисунок 4). Эти микроРНК (i) были тканево-специфическими для ткани плаценты (Рис. 3), (ii) имели статистически значимые отличия в уровнях их экспрессии в ткани плаценты от пациенток с ПЭ на момент родов, делали наибольший вклад в разделение образцов сыворотки крови беременных в 11-14 недель гестации, у которых позже развились клинические симптомы ПЭ или не было признаков ПЭ (Рисунок 2) по данным МНК, и (iv) имели статистически значимые корреляции между их содержанием в сыворотке крови или со средним уровнем артериального давления, или с индексом пульсации маточной артерии, или с b-ХГЧ, или с PAPPA на 11-14 неделе гестации (табл. 3 и табл. 4). Из этих 17 микроРНК, согласно базе данных miRWalk, доказано, что 7 микроРНК причастны к преэклампсии (miR-451a), плацентарной недостаточности и преэклампсии (miR-22-5p, miR-1246, miR-146b-5p, miR-320e и miR-1307-3p), плацентарной недостаточности, сосудистых заболеваниях и преэклампсии (miR-20a-5p) через посттранскрипционное влияние на экспрессию генов-мишеней. Одновременное выявление 3 микроРНК (let-7d-3p, miR-451a, и miR-1307-3p), устойчивых к многократному замораживанию/оттаиванию образцов сыворотки крови, в сочетании с биохимическими (b-ХГЧ и PAPP-A) и ультразвуковыми (ИПМА) показателями позволило разработать универсальную модель для прогнозирования наступления рПЭ и пПЭ (ЛПУ = 15. 7% и ЛОУ = 9,5%), валидизированную на тестовой когорте пациентов, которая продемонстрировала ложноположительные результаты в 26,7% случаев и ложноотрицательные – в 5,6% случаев. Для сравнения, использование общепринятой программы Astraia в анализе тестовой когорты пациентов привело к меньшей прогностической силе: ЛПУ = 62,1 % и ЛОУ = 33,3%.

Хорошо известно, что ген семейства let-7 играет ключевую роль в развитии плаценты и плода [38,39], а его уровень контролируется РНК-связывающим белком Lin28, который является естественным ингибитором процессинга let-7 на пре-микроРНК-этапе [40]. В свою очередь, Lin28 непосредственно увеличивает свою активность через Wnt/β-катенин, отвечающий за спецификацию линии TE через транскрипционный фактор Cdx2 [41]. В то же время, через таргетирование Tead4 микроРНК let-7 влияют на уровень экспрессии Cdx2, ключевого транскрипционного фактора сигнального пути Hippo, который вызывает развитие трофэктодермы через взаимодействие с нефосфорилированным YAP1 в ядре внешних клеток бластоцисты [42]. Показано, что специфический для трофэктодермы нокдаун LIN28A/B повышает уровень микроРНК let-7 в бластоцистах и приводит к снижению уровня экспрессии определенных генов-мишеней, ответственных за пролиферацию, инвазию, миграцию, синцитиализацию, иммунную толерантность, ангиогенез и целостность сосудов, включая гены коллагена COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A1 и COL5A2; показано, что вместе с RAMP2 все эти гены вовлечены в положительную регуляцию каскада ERK1/2, канонического Wnt- и TGF-бета, а также генов PPAR-, PI3K-AKT- и сигнальных путей Hippo [39]. Установлено, что уровень микроРНК let-7 влияет на миграцию и инвазию клеток экстравилезного трофобласта через влияние на уровень экспрессии их общей генной мишени MDM4 [43]. Измененные уровни микроРНК let-7 были обнаружены при ассоциированных с беременностью расстройствах, таких как преэклампсия [44,45]. В данном исследовании мы обнаружили статистически значимое снижение уровней экспрессии let-7f-5p, let-7c-5p, let-7b-3p, let-7i-5p, let-7a-3p, let-7d-3p и let-7b-5p и повышение уровней экспрессии let-7e-5p и let-7e-3p в плаценте; в плазме крови выявлено снижение содержания let-7b-5p у пациенток с рПЭ на момент родоразрешения. В случае ПЭ мы обнаружили статистически значимое повышение уровня экспрессии let-7c-5p, let-7i-5p, let-7a-3p, let-7d-3p, let-7b-5p и let-7d-5p, снижение уровня экспрессии let-7e-5p в плаценте и уменьшение содержания let-7e-5p и let-7a-3p в плазме крови на момент родоразрешения. То есть, при сравнении ранней и поздней ПЭ в третьем триместре беременности выявлена разная направленность изменений экспрессии генов, кодирующих микроРНК let-7c-5p, let-7i-5p, let-7a-3p, let-7d-3p и let-7b-5p в плаценте, что с точки зрения их влияния на пролиферацию, дифференциацию, инвазию и миграцию клеток трофобласта (см. выше) отражает различия в патогенезе двух форм ПЭ. Эти различия также подчеркивает тот факт, что одной из мишеней let-7 является Dicer [46], который контролирует биогенез зрелых микроРНК, а следовательно, способствует тонкой настройке уровней их многочисленных генов-мишеней, формирующих различные сигнальные пути в клетке. Анализ транскриптома сыворотки крови беременных на 11-13 неделе гестации с последующим развитием рПЭ выявил снижение уровней let-7d-5p, let-7d-3p, let-7f-5p, let-7a-5p, let-7g-5p, let-7i-5p, let-7c-5p, let-7b-3p и let-7e-5p, а также повышенные уровни let-7b-5p и let-7a-3p, тогда как в случае пПЭ повышенные уровни были обнаружены для let-7e-5p, let-7g-5p, let-7f-5p, let-7a-5p, let-7c-5p, let-7i-5p и let-7a-3p, а пониженные уровни были обнаружены для let-7b-5p, let-7b-3p, let-7d-5p и let-7d-3p. Сравнивая рПЭ и пПЭ, в сыворотке периферической крови первого триместра выявлена разная направленность изменений концентраций let-7f-5p, let-7a-5p, let-7g-5p, let-7i-5p, let-7c-5p и let-7b-5p, что подчеркивает патогенетические различия между двумя формами ПЭ еще до появления клинических проявлений. Напротив, в сыворотке крови пациенток с ранним и поздним ПЭ в первом триместре выявлена одинаковая направленность изменений уровней let-7d-5p, let-7d-3p, let-7a-3p и let-7b-3p, что указывает на наличие некоторых общих патогенетических механизмов для двух форм ПЭ. Например, по данным литературы, let-7d-3p влияет на сигнальные пути, регулирующие иммунный ответ и воспалительные процессы, включая сигнальный путь, опосредованный Т-клеточным рецептором, VEGFR и MAPK [47]. Кроме того, геном-мишенью let-7d-3p является ДНК-метилтрансфераза 1 (DNMT1), которая регулирует метилирование промоторов Notch1, PU.1 и Klf4 – критических регуляторов поляризации M1/M2 [48].

Имплантация эмбриона и дальнейшее развитие материнско-плодового интерфейса зависят от дифференцировки цитотрофобласта плаценты человека первого триместра в экстравилезный трофобласт путем эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) [49]. Среди микроРНК, определенных в этом исследовании как прогностические маркеры развития ранней и поздней ПЭ, по данным литературы, в ЭМП участвуют семейства let-7, miR-20a-5p, miR-451a, miR-22-5p и miR-30e-5p. В частности, доказана роль оси Wnt/β-катенин-lin28a/let-7 в ЭМП [38]. miR-20a-5p способствует ЭМП через усиление регуляции экспрессии мезенхимального маркера виментина и ингибирование экспрессии эпителиального маркера Е-кадгерина через таргетирование орфанного ядерного рецептора NR4A3 [50]. miR-451a считается репрессором ЭМП через ингибирование металлопротеазы ADAM10, которая регулирует ангиогенез, клеточную миграцию и пролиферацию [51]. miR-22 запускает ЭМП путем ингибирования трансляции SFRP2 и PCDH15, которые подавляют путь Wnt/b-катенина, необходимый для роста, инвазии и стволовых клеток [52]. miR-30e-5p подавляет пролиферацию, миграцию и инвазию клеток через таргетирование белка (SNAI1), усиление активности которого является основной характеристикой ЭМП [53]. Кроме того, было обнаружено, что уровни экспрессии let-7d-5p и miR-20a-5p были повышены [54,55], тогда как уровень экспрессии let-7i-5p был снижен [56] в тканях плаценты или образцах плазмы крови, собранных у пациентов с ПЭ. Кроме того, было установлено, что miR-20a-5p в сочетании с miR-143-3p, miR-145-5p, miR-146a-5p, miR-181a-5p и miR-574-3p являются прогностическими молекулами в оценке развития поздней ПЭ путем определения их содержания в лейкоцитах периферической крови в первом триместре беременности [57].

Известно, что гипоксия играет разную роль в плацентогенезе в зависимости от срока беременности: в первом триместре беременности она способствует инвазии трофобласта и ангиогенезу [58], но длительное гипоксическое состояние после первого триместра вызывает недостаточную синцитиализацию трофобласта, неадекватную инвазию трофобласта и нарушение ремоделирования сосудов, что приводит к плацентарной дисфункции и гипертензии, вызванной беременностью, такой как преэклампсия/задержка внутриутробного роста [59,60]. Некоторые микроРНК являются чувствительными к гипоксии молекулами [61,62,63], среди которых есть плацентарно-специфические микроРНК, идентифицированные в данном исследовании как маркеры, ассоциирующиеся с преэклампсией. К ним относятся следующие: mir-30e-5p, снижающий активность в гипоксических условиях и вызывающий апоптоз через таргетирование Bim [64]; пониженный уровень miR-320e, который считается маркером острого инсульта у человека [65]; ось miR-451a/MEF2D, на которую влияют кислые условия при гипоксии/ишемии, контролирующая пролиферацию, миграцию и инвазию клеток через сигнальный путь Akt/GSK-3β [66]; ось miR-451a/MIF, ключевой регулятор воспалительных процессов при гипоксических условиях [67]; miR-22, который индуцируется в результате ишемически-реперфузионного повреждения миокарда и способен ингибировать апоптоз кардиомиоцитов через таргетирование белка cAMP клеточного фактора транскрипции (CREB), который регулирует проапоптотические гены (Bax и p21) [68]; и miR-1307-3p, что транскрипционно модулируется Hif-1α и способствует ангиогенезу, клеточной пролиферации и инвазии через ингибирование DAB2IP и активацию сигнализации AKT/mTOR [69].

Снижение маточно-плацентарной перфузии индуцирует плацентарное высвобождение антиангиогенных факторов в материнский кровоток, что приводит к эндотелиальной дисфункции и системной сосудистой дисфункции. Установлено, что miR-30e-5p может служить циркулирующим биомаркером микрососудистой дисфункции, которая связана с целевой регуляцией генов, ответственных за биосинтез жирных кислот, что, в свою очередь, приводит к усилению β-окисления жирных кислот, оксидативного стресса и снижению уровня eNOS [70]. С помощью нокдауна эндогенных микроРНК в эндотелиальных клетках человека были идентифицированы некоторые из их генов-мишеней, участвующих в регуляции сосудистой функции и артериального давления: FGF5 и ADRB1 для let-7b, let-7c, let-7e и let-7g; ADRA2A и ADRA2B для miR-30e-5p; и ADM, TBX3, EDNBB и NOX4 для miR-92a-3p [71]. Не исключено, что дисбаланс уровней экспрессии этих пар микроРНК/мРНК определяет наличие гипертензивных расстройств при преэклампсии.

Хорошо известно, что гипоксия/ишемия в плаценте является мощным генератором оксидативного стресса, который стимулирует повышенную секрецию провоспалительных цитокинов, таких как TNFα и IL-1ß, а также приводит к усилению трофобластического апоптоза [72]. Окислительный стресс может влиять на уровень экспрессии определенных микроРНК и, наоборот, микроРНК могут изменять экспрессию критических компонентов клеточных антиоксидантов [73]. Например, miR-93 может снижать уровень Nrf2, который активирует транскрипцию генов, кодирующих антиоксидантные ферменты [74]. В свою очередь, Nrf2 связывается с промотором гена miR-1246, обеспечивая его экспрессию [75]. Выявлено значительное увеличение экспрессии генов Nrf2 и miR-1246 во время дифференцировки синцитиотрофобласта человека и заметное снижение уровней их экспрессии в плацентах женщин с тяжелой преэклампсией [75]. Важно отметить, что гены-мишени miR-1246 являются ингибиторами сигнализации WNT/b-катенинов (GSK3b и AXIN2), которые имеют решающее значение для развития плаценты. Этот вывод подчеркивает важность использования miR-1246 в нашей модели логистической регрессии для прогнозирования развития ранней и поздней преэклампсии во время первого скрининга беременных женщин.

Существует тесная взаимосвязь между стрессом ЭР и оксидативным стрессом в патогенезе преэклампсии [72]: два типа внутриклеточного стресса вызваны ишемией-реперфузией и гипоксией, а развернутый белковый ответ (РБВ) в случае накопления неправильно свернутых белков может активировать некоторые из тех же внутриклеточных воспалительных сигнальных путей, что и оксидативный стресс (пути NF-κB и p38MAPK). В этом исследовании мы определили miR-1307-3p как ранний прогностический маркер преэклампсии, что имеет потенциал влияния на белок метилтрансферазы 8 (METTL8), который, в свою очередь, подавляет экспрессию KDM3A/3B и уменьшает метилирование девятого лизина гистона H3, обеспечивая таким образом связывание P300 и РНК pol II с промоторным участком эндоплазматического ретикулума UPR эффекторного белка CALR [76]. Мы обнаружили снижение уровня miR-1307-3p в сыворотке крови женщин с ранним или поздним ПЭ в первом триместре, что свидетельствует о нарушении функционирования UPR-сигнализации эндоплазматического ретикулума еще до начала клинических проявлений ПЭ. На момент родоразрешения плацентарная ткань женщин с рПЭ имела пониженный уровень miR-1307-3p, а в случае пПЭ – повышенный уровень miR-1307-3p, что, вероятно, свидетельствует об устранении компенсаторных механизмов стресса эндоплазматического ретикулума и более поздней манифестации симптомов ПЭ по сравнению с рПЭ. В нашем недавнем исследовании мы проанализировали сыворотку крови беременных женщин на уровень секреторного кластерина, который является внутри- и внеклеточным шапероном и участвует в процессах, индуцированных стрессом ЭР [31]. Выявлена высокая степень прогнозирования развития ранней и поздней ПЭ по уровню секреторного кластерина задолго до начала клинических проявлений этих осложнений беременности.

Таким образом, плацентоспецифические микроРНК, идентифицированные в данном исследовании как маркеры прогнозирования развития ранней и поздней ПЭ на доклинической стадии заболевания, участвуют в основных процессах ее патогенеза, а именно: нарушении дифференцировки пролиферативной и инвазивной способности клеток цитотрофобласта, что приводит к патологическому ремоделированию спиральных маточных артерий и повышению их резистентности, вызывая гипоксически-ишемическое повреждение плацентарной ткани и возникновение оксидативного/стресса эндоплазматического ретикулума; воспалительных реакций; системного эндотелиоза; полиорганной дисфункции/недостаточности. Очевидно, что чем лучше мы будем понимать патогенез преэклампсии и чем раньше ее диагностировать, тем шире будет спектр лекарственных средств, которые потенциально могут быть использованы для лечения преэклампсии, и тем выше будет эффективность этих препаратов. Низкие дозы аспирина пока являются единственным профилактическим препаратом, рекомендованным пациенткам с повышенным риском преэклампсии. Однако гидроксихлорохин предлагается как перспективный препарат для профилактики и лечения преэклампсии, поскольку он оказывает противовоспалительное, антиоксидантное и антитромботическое действие [77].

4. Материалы и методы

4.1. Пациентки

Всего было отобрано 115 пациенток в возрасте 25-40 лет, находившихся на стационарном лечении в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова в отделении ведения беременности и родов, от которых было получено информированное согласие на участие в исследовании; исследование было одобрено этическим комитетом Центра. Каждой пациентке проводили клинический и биохимический анализы крови, ультразвуковое исследование органов малого таза и плода, допплерометрию фето-плацентарного кровотока, кардиотокографию, измерение артериального давления, определение уровня белка в моче, концентраций PLGF, sFlt-1, PAPP-A и β-ХГЧ в сыворотке крови с помощью диагностических тест-систем. Критериями для недопущения к исследованию были наступление беременности с помощью вспомогательных репродуктивных технологий, многоплодная беременность, анеуплоидия плода.

4.2. Выделение РНК из плазмы или сыворотки крови

Для выделения РНК использовали 200 мкл плазмы или сыворотки крови, очищенной от клеток и клеточных остатков с помощью ступенчатого центрифугирования при 300× g в течение 20 мин и при 16 000× g в течение 10 мин, с использованием набора miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen, Hilden, Германия) после предварительного добавления 5. 6×108 копий синтетической РНК cel-miR-39 (Qiagen, Hilden, Германия) после инкубации плазмы/сыворотки с реагентом QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Hilden, Германия) для контроля эффективности экстракции РНК и синтеза кДНК в соответствии с рекомендациями производителя.

4.3. Выделение РНК из ткани плаценты

Образцы плацентарной ткани забирали для исследования не позднее чем через 10 минут после родов. Срез ткани толщиной 5 мм забирали, проводя инструмент через всю плаценту от поверхности плода к поверхности матери в месте примерно на полпути между местом прикрепления пуповины и краем плаценты в области, свободной от любых очевидных аномалий, как рекомендовано Burton GJ и соавт. [78]. Отобранную плацентарную ткань, свободную от плодных оболочек, промывали в 0,9% NaCl и немедленно замораживали в жидком азоте для дальнейшего хранения при -80 °С. Тотальную РНК экстрагировали из 20-40 мг плацентарной ткани с помощью набора miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Германия) с последующим использованием набора для очистки RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Концентрацию РНК измеряли на флуориметре Qubit 3.0 (Life Technologies, Petaling Jaya, Малайзия). Качество образцов тотальной РНК исследовали с помощью Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, Вальдбронн, Германия) и набора RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Для дальнейших исследований использовали образцы тотальной РНК с соотношением 28S/18S рибосомной РНК 1,5-1,8.

4.4. Глубокое секвенирование микроРНК

Библиотеки кДНК синтезировали с использованием 6 мкл элюата колоны тотальной РНК (miRNeasy Serum/Plasma Kit), экстрагированного из 200 мкл сыворотки или плазмы крови, и 500 нг тотальной РНК из ткани плаценты с использованием набора NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set для Illumina® (Set11 и Set2, New England Biolab®, Франкфурт-на-Майне, Германия, кат. №№ E7300S и E7580S), амплифицировали за 19 и 14 циклов ПЦР соответственно и секвенировали на платформе NextSeq 500 (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США, кат. № SY-415-1001). Адаптеры удаляли с помощью Cutadapt. Все обрезанные считывания, короче 16 п.н. и длиннее 55 п.н., были отфильтрованы, и только считывания со средним качеством выше 15 были сохранены. Остальные считывания были сопоставлены с геномом человека GRCh38.p15 и miRBase v21 с помощью выравнивателя Bowtie [79]. Выровненные считывания подсчитывали с помощью инструмента featureCount из пакета Subread [80] и опцию fracOverlap 0.9; таким образом, все чтения должны были иметь 90% пересечение с признаками sncRNA. Анализ дифференциальной экспрессии данных подсчета sncRNA проводился с помощью пакета DESeq2. [81].

4.5. Обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени

Пять микролитров из четырнадцати мкл элюата колонки тотальной РНК (miRNeasy Serum/Plasma Kit, Qiagen, Hilden, Германия), выделенной из двухсот мкл сыворотки крови, преобразовали в кДНК в соответствии с протоколом miScript® II RT Kit (Qiagen, Hilden, Германия); затем объем образца доводили до 200 мкл с помощью деионизированной воды. Синтезированную кДНК (2 мкл) использовали как шаблон для ПЦР в реальном времени с использованием прямого праймера, специфичного к исследуемой микроРНК (табл. 6), и набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Использовали следующие условия проведения ПЦР: (1) 15 мин при 95 °С и (2) 50 циклов при 94 °С в течение 15 с, оптимизированная температура отжига (52-62 °С) в течение 30 с и 70 °С в течение 30 с в термоциклере StepOnePlusTM (Applied Biosystems, Waltham, MA, США). Относительную экспрессию микроРНК в образцах сыворотки крови определяли методом ∆Ct, используя cel-39 в качестве референсной РНК.

Таблица 6. Характеристики последовательностей микроРНК, проанализированных с помощью ПЦР в реальном времени.

4.6. Статистический анализ полученных данных

Для статистической обработки использовали скрипты, написанные на языке R  [80] и RStudio [82]. Соответствие анализируемых параметров нормальному закону распределения оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Когда распределение данных отличалось от нормального, использовали критерий Манна-Уитни для попарных сравнений. Поскольку анализировались как количественные, так и качественные характеристики, проводился ранговый корреляционный анализ с использованием непараметрического корреляционного теста Спирмена. 95% доверительный интервал для коэффициента корреляции определялся с помощью преобразования Фишера. Значение порогового уровня значимости (р) было принято равным 0,05.

5. Заключение

Универсальная модель для прогнозирования начала рПЭ и пПЭ путем одновременного выявления бесклеточных плацентарно-специфических микроРНК (let-7d-3p, miR-451a, и miR-1307-3p), устойчивых к многократному замораживанию/размораживанию образцов сыворотки крови в сочетании с биохимическими (b-ХГЧ и РАРР-А) и ультразвуковыми (ИПМА) показателями в I триместре беременности, разработан на учебной когорте из 40 пациенток (ЛПУ = 15. 7% и ЛОУ = 9,5%), и был валидирован на тестовой когорте из 48 пациенток с ложноположительными результатами в 26,7% случаев и ложноотрицательными в 5,6% случаев. Для сравнения, использование общепринятой программы Astraia в анализе тестовой когорты пациентов привело к менее прогностическим результатам: ЛПУ = 62,1% и ЛОУ = 33,3%. Участие этих микроРНК в пролиферации трофобласта, инвазии, миграции, синцитиализации, развернутом белковом ответе эндоплазматического ретикулума, иммунной толерантности, ангиогенезе и целостности сосудов, согласно данным литературы, подчеркивает важность их использования в качестве прогностических молекул для выявления ПЭ при скрининге беременных в первом триместре.

Ссылки на источники

1. Burton, G.J.; Redman, C.W.; Roberts, J.M.; Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ 2019, 366, l2381.
2. Ananth, C.V.; Lavery, J.A.; Friedman, A.M.; Wapner, R.J.; Wright, J.D. Serious maternal complications in relation to severe pre-eclampsia: A retrospective cohort study of the impact of hospital volume. BJOG 2017, 124, 1246–1253.
3. Brown, M.A.; Magee, L.A.; Kenny, L.C.; Karumanchi, S.A.; McCarthy, F.P.; Saito, S.; Hall, D.R.; Warren, C.E.; Adoyi, G.; Ishaku, S. The hypertensive disorders of pregnancy: ISSHP classification, diagnosis & management recommendations for international practice. Pregnancy Hypertens. 2018, 13, 291–310.
4. Pierrat, V.; Marchand-Martin, L.; Arnaud, C.; Kaminski, M.; Resche-Rigon, M.; Lebeaux, C.; Bodeau-Livinec, F.; Morgan, A.S.; Goffinet, F.; Marret, S.; et al. Neurodevelopmental outcome at 2 years for preterm children born at 22 to 34 weeks’ gestation in France in 2011: EPIPAGE-2 cohort study. BMJ 2017, 358, j3448.
5. van Beek, P.E.; Rijken, M.; Broeders, L.; Ter Horst, H.J.; Koopman-Esseboom, C.; de Kort, E.; Laarman, C.; Mulder-de Tollenaer, S.M.; Steiner, K.; Swarte, R.M.; et al. Two-year neurodevelopmental outcome in children born extremely preterm: The EPI-DAF study. Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed. 2022, 107, 467–474.
6. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: Challenging the current hypothesis. Hypertension 2008, 51, 970–975.
7. Garrido-Gomez, T.; Dominguez, F.; Quiñonero, A.; Diaz-Gimeno, P.; Kapidzic, M.; Gormley, M.; Ona, K.; Padilla-Iserte, P.; McMaster, M.; Genbacev, O.; et al. Defective decidualization during and after severe preeclampsia reveals a possible maternal contribution to the etiology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114, E8468–E8477.
8. Ruane, P.T.; Berneau, S.C.; Koeck, R.; Watts, J.; Kimber, S.J.; Brison, D.R.; Westwood, M.; Aplin, J.D. Apposition to endometrial epithelial cells activates mouse blastocysts for implantation. Mol. Hum. Reprod. 2017, 23, 617–627.
9. Myatt, L. Review: Reactive oxygen and nitrogen species and functional adaptation of the placenta. Placenta 2010, 31, S66–S69.
10. Pijnenborg, R.; Bland, J.M.; Robertson, W.B.; Brosens, I. Uteroplacental arterial changes related to interstitial trophoblast migration in early human pregnancy. Placenta 1983, 4, 397–413.
11. Burton, G.J.; Woods, A.W.; Jauniaux, E.; Kingdom, J.C.P. Rheological and Physiological Consequences of Conversion of the Maternal Spiral Arteries for Uteroplacental Blood Flow during Human Pregnancy. Placenta 2009, 30, 473–482.
12. James, J.L.; Saghian, R.; Perwick, R.; Clark, A.R. Trophoblast plugs: Impact on utero-placental haemodynamics and spiral artery remodelling. Hum. Reprod. 2018, 33, 1430–1441.
13. Allerkamp, H.H.; Clark, A.R.; Lee, T.C.; Morgan, T.K.; Burton, G.J.; James, J.L. Something old, something new: Digital quantification of uterine vascular remodelling and trophoblast plugging in historical collections provides new insight into adaptation of the utero-placental circulation. Hum. Reprod. 2021, 36, 571–586.
14. Staff, A.C.; Fjeldstad, H.E.; Fosheim, I.K.; Moe, K.; Turowski, G.; Johnsen, G.M.; Alnaes-Katjavivi, P.; Sugulle, M. Failure of physiological transformation and spiral artery atherosis: Their roles in preeclampsia. Am. J. Obstet. Gynecol. 2022, 226, S895–S906.
15. Sidorova, I.S. Solved and unsolved problems of preeclampsia in Russia (Editorial). Russ. Bull. Obstet. 2015, 15, 4–9.
16. Rana, S.; Burke, S.D.; Karumanchi, S.A. Imbalances in circulating angiogenic factors in the pathophysiology of preeclampsia and related disorders. Am. J. Obstet. Gynecol. 2022, 226, S1019–S1034.
17. Haram, K.; Mortensen, J.H.; Myking, O.; Magann, E.F.; Morrison, J.C. The Role of Oxidative Stress, Adhesion Molecules and Antioxidants in Preeclampsia. Curr. Hypertens. Rev. 2019, 15, 105–112.
18. Tomimatsu, T.; Mimura, K.; Matsuzaki, S.; Endo, M.; Kumasawa, K.; Kimura, T. Preeclampsia: Maternal Systemic Vascular Disorder Caused by Generalized Endothelial Dysfunction Due to Placental Antiangiogenic Factors. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 4246.
19. Staff, A.C. The two-stage placental model of preeclampsia: An update. J. Reprod. Immunol. 2019, 134–135, 1–10.
20. Kohan-Ghadr, H.-R.; Kadam, L.; Jain, C.; Armant, D.R.; Drewlo, S. Potential role of epigenetic mechanisms in regulation of trophoblast differentiation, migration, and invasion in the human placenta. Cell Adh. Migr. 2016, 10, 126–135.
21. Skalis, G.; Katsi, V.; Miliou, A.; Georgiopoulos, G.; Papazachou, O.; Vamvakou, G.; Nihoyannopoulos, P.; Tousoulis, D.; Makris, T. MicroRNAs in Preeclampsia. MicroRNA 2019, 8, 28–35.
22. Lv, Y.; Lu, C.; Ji, X.; Miao, Z.; Long, W.; Ding, H.; Lv, M. Roles of microRNAs in preeclampsia. J. Cell. Physiol. 2019, 234, 1052–1061.
23. Xu, P.; Zhao, Y.; Liu, M.; Wang, Y.; Wang, H.; Li, Y.; Zhu, X.; Yao, Y.; Wang, H.; Qiao, J.; et al. Variations of MicroRNAs in Human Placentas and Plasma From Preeclamptic Pregnancy. Hypertension 2014, 63, 1276–1284.
24. Chen, D.; Wang, W. Human placental microRNAs and preeclampsia. Biol. Reprod. 2013, 88, 130.
25. Winger, E.E.; Reed, J.L.; Ji, X.; Nicolaides, K. Peripheral blood cell microRNA quantification during the first trimester predicts preeclampsia: Proof of concept. PLoS ONE 2018, 13, e0190654.
26. Devor, E.; Santillan, D.; Scroggins, S.; Warrier, A.; Santillan, M. Trimester-specific plasma exosome microRNA expression profiles in preeclampsia. J. Matern.-Fetal Neonatal Med. Off. J. Eur. Assoc. Perinat. Med. Fed. Asia Ocean. Perinat. Soc. Int. Soc. Perinat. Obstet. 2020, 33, 3116–3124.
27. Hromadnikova, I.; Dvorakova, L.; Kotlabova, K.; Krofta, L. The Prediction of Gestational Hypertension, Preeclampsia and Fetal Growth Restriction via the First Trimester Screening of Plasma Exosomal C19MC microRNAs. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2972.
28. Licini, C.; Avellini, C.; Picchiassi, E.; Mensà, E.; Fantone, S.; Ramini, D.; Tersigni, C.; Tossetta, G.; Castellucci, C.; Tarquini, F.; et al. Pre-eclampsia predictive ability of maternal miR-125b: A clinical and experimental study. Transl. Res. 2021, 228, 13–27.
29. De La Calle, M.; Delgado, J.L.; Verlohren, S.; Escudero, A.I.; Bartha, J.L.; Campillos, J.M.; Aguarón De La Cruz, A.; Chantraine, F.; García Hernández, J.Á.; Herraiz, I.; et al. Gestational Age-Specific Reference Ranges for the sFlt-1/PlGF Immunoassay Ratio in Twin Pregnancies. Fetal Diagn. Ther. 2021, 48, 288–296.
30. Coenen-Stass, A.M.L.; Pauwels, M.J.; Hanson, B.; Martin Perez, C.; Conceição, M.; Wood, M.J.A.; Mäger, I.; Roberts, T.C. Extracellular microRNAs exhibit sequence-dependent stability and cellular release kinetics. RNA Biol. 2019, 16, 696–706.
31. Timofeeva, A.; Fedorov, I.; Tarasova, A.; Gorina, K.; Suhova, Y.; Gusar, V.; Ivanets, T. Role of clusterin in predicting development of early- and late-onset preeclampsia in the first trimester of pregnancy. Bull. Russ. State Med. Univ. 2022, 60–71.
32. Morales-Prieto, D.M.; Chaiwangyen, W.; Ospina-Prieto, S.; Schneider, U.; Herrmann, J.; Gruhn, B.; Markert, U.R. MicroRNA expression profiles of trophoblastic cells. Placenta 2012, 33, 725–734.
33. Morales-Prieto, D.M.; Ospina-Prieto, S.; Chaiwangyen, W.; Schoenleben, M.; Markert, U.R. Pregnancy-associated miRNA-clusters. J. Reprod. Immunol. 2013, 97, 51–61.
34. Mouillet, J.-F.; Ouyang, Y.; Coyne, C.B.; Sadovsky, Y. MicroRNAs in placental health and disease. Am. J. Obstet. Gynecol. 2015, 213, S163–S172.
35. Timofeeva, A.V.; Fedorov, I.S.; Shamina, M.A.; Chagovets, V.V.; Makarova, N.P.; Kalinina, E.A.; Nazarenko, T.A.; Sukhikh, G.T. Clinical Relevance of Secreted Small Noncoding RNAs in an Embryo Implantation Potential Prediction at Morula and Blastocyst Development Stages. Life 2021, 11, 1328.
36. Timofeeva, A.; Drapkina, Y.; Fedorov, I.; Chagovets, V.; Makarova, N.; Shamina, M.; Kalinina, E.; Sukhikh, G. Small Noncoding RNA Signatures for Determining the Developmental Potential of an Embryo at the Morula Stage. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 9399.
37. Timofeeva, A.V.; Chagovets, V.V.; Drapkina, Y.S.; Makarova, N.P.; Kalinina, E.A.; Sukhikh, G.T. Cell-Free, Embryo-Specific sncRNA as a Molecular Biological Bridge between Patient Fertility and IVF Efficiency. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2912.
38. Li, Q.; Shi, J.; Liu, W. The role of Wnt/β-catenin-lin28a/let-7 axis in embryo implantation competency and epithelial-mesenchymal transition (EMT). Cell Commun. Signal. 2020, 18, 108.
39. Ali, A.; Iqbal, M.A.; Abbas, M.W.; Bouma, G.J.; Anthony, R.V.; Spencer, T.E.; Winger, Q.A. Trophectoderm Transcriptome Analysis in LIN28 Knockdown Ovine Conceptuses Suggests Diverse Roles of the LIN28-let-7 Axis in Placental and Fetal Development. Cells 2022, 11, 1234.
40. Piskounova, E.; Polytarchou, C.; Thornton, J.E.; LaPierre, R.J.; Pothoulakis, C.; Hagan, J.P.; Iliopoulos, D.; Gregory, R.I. Lin28A and Lin28B inhibit let-7 microRNA biogenesis by distinct mechanisms. Cell 2011, 147, 1066–1079.
41. Xie, H.; Tranguch, S.; Jia, X.; Zhang, H.; Das, S.K.; Dey, S.K.; Kuo, C.J.; Wang, H. Inactivation of nuclear Wnt-beta-catenin signaling limits blastocyst competency for implantation. Development 2008, 135, 717–727.
42. Liu, W.; Chen, J.; Yang, C.; Lee, K.-F.; Lee, Y.-L.; Chiu, P.C.-N.; Zhang, Y.; Duan, Y.-G.; Liu, K.; Yeung, W.S.-B. Expression of microRNA let-7 in cleavage embryos modulates cell fate determination and formation of mouse blastocysts†. Biol. Reprod. 2022, 107, 1452–1463.
43. Zhang, L.; Wang, K.; Wu, Q.; Jin, L.; Lu, H.; Shi, Y.; Liu, L.; Yang, L.; Lv, L. Let-7 inhibits the migration and invasion of extravillous trophoblast cell via targeting MDM4. Mol. Cell. Probes 2019, 45, 48–56.
44. Wang, D.; Liu, N.; Tian, Y.; Li, Y.; Shen, X.; Chen, Y.; Wu, F. Expression profile of Let-7s in peripheral blood mononuclear cells of normal and severe preeclampsia pregnant women. Exp. Mol. Pathol. 2019, 110, 104263.
45. Caldeira-Dias, M.; Luizon, M.R.; Deffune, E.; Tanus-Santos, J.E.; Freire, P.P.; Carvalho, R.F.; Bettiol, H.; Cardoso, V.C.; Antonio Barbieri, M.; Cavalli, R.C.; et al. Preeclamptic plasma stimulates the expression of miRNAs, leading to a decrease in endothelin-1 production in endothelial cells. Pregnancy Hypertens. 2018, 12, 75–81.
46. Tokumaru, S.; Suzuki, M.; Yamada, H.; Nagino, M.; Takahashi, T. let-7 regulates Dicer expression and constitutes a negative feedback loop. Carcinogenesis 2008, 29, 2073–2077.
47. Qiu, G.; Fan, J.; Zheng, G.; He, J.; Lin, F.; Ge, M.; Huang, L.; Wang, J.; Xia, J.; Huang, R.; et al. Diagnostic Potential of Plasma Extracellular Vesicle miR-483-3p and Let-7d-3p for Sepsis. Front. Mol. Biosci. 2022, 9, 814240.
48. Yan, J.; Tie, G.; Wang, S.; Tutto, A.; DeMarco, N.; Khair, L.; Fazzio, T.G.; Messina, L.M. Diabetes impairs wound healing by Dnmt1-dependent dysregulation of hematopoietic stem cells differentiation towards macrophages. Nat. Commun. 2018, 9, 33.
49. DaSilva-Arnold, S.C.; Zamudio, S.; Al-Khan, A.; Alvarez-Perez, J.; Mannion, C.; Koenig, C.; Luke, D.; Perez, A.M.; Petroff, M.; Alvarez, M.; et al. Human trophoblast epithelial-mesenchymal transition in abnormally invasive placenta. Biol. Reprod. 2018, 99, 409–421.
50. Yang, H.; Chen, Z.; Liu, Z. MiR-20a-5p Negatively Regulates NR4A3 to Promote Metastasis in Bladder Cancer. J. Oncol. 2021, 2021, 1377989.
51. Xu, Y.; Lai, Y.; Cao, L.; Li, Y.; Chen, G.; Chen, L.; Weng, H.; Chen, T.; Wang, L.; Ye, Y. Human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived exosomal microRNA-451a represses epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by inhibiting ADAM10. RNA Biol. 2021, 18, 1408–1423.
52. Han, M.; Wang, S.; Fritah, S.; Wang, X.; Zhou, W.; Yang, N.; Ni, S.; Huang, B.; Chen, A.; Li, G.; et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain 2020, 143, 512–530.
53. Liang, Z.; Tang, S.; He, R.; Luo, W.; Qin, S.; Jiang, H. The effect and mechanism of miR-30e-5p targeting SNAI1 to regulate epithelial-mesenchymal transition on pancreatic cancer. Bioengineered 2022, 13, 8013–8028.
54. Xu, Q.; Song, Y.; Lu, L. Overexpression of let-7d explains down-regulated KDM3A and ENO2 in the pathogenesis of preeclampsia. J. Cell. Mol. Med. 2021, 25, 8127–8139.
55. Ojeda-Casares, H.; Paradisi, I. The Regulatory Network Played by miRNAs During Normal Pregnancy and Preeclampsia: A Comparative Study. MicroRNA 2021, 10, 263–275.
56. Xu, Y.; Huang, X.; Xie, J.; Chen, Y.; Fu, J.; Wang, L. Let-7i-Induced Atg4B Suppression Is Essential for Autophagy of Placental Trophoblast in Preeclampsia. J. Cell. Physiol. 2017, 232, 2581–2589.
57. Hromadnikova, I.; Kotlabova, K.; Krofta, L. Cardiovascular Disease-Associated MicroRNA Dysregulation during the First Trimester of Gestation in Women with Chronic Hypertension and Normotensive Women Subsequently Developing Gestational Hypertension or Preeclampsia with or without Fetal Growth Restr. Biomedicines 2022, 10, 256.
58. Jauniaux, E.; Watson, A.; Burton, G. Evaluation of respiratory gases and acid-base gradients in human fetal fluids and uteroplacental tissue between 7 and 16 weeks’ gestation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2001, 184, 998–1003.
59. Zhou, H.; Zhao, C.; Wang, P.; Yang, W.; Zhu, H.; Zhang, S. Regulators involved in trophoblast syncytialization in the placenta of intrauterine growth restriction. Front. Endocrinol. 2023, 14, 1107182.
60. Zhao, H.; Wong, R.J.; Stevenson, D.K. The Impact of Hypoxia in Early Pregnancy on Placental Cells. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 9675.
61. Chen, Y.; He, Y.; Zhao, S.; He, X.; Xue, D.; Xia, Y. Hypoxic/Ischemic Inflammation, MicroRNAs and δ-Opioid Receptors: Hypoxia/Ischemia-Sensitive Versus-Insensitive Organs. Front. Aging Neurosci. 2022, 14, 847374.
62. Jiang, H.; Zhao, H.; Zhang, M.; He, Y.; Li, X.; Xu, Y.; Liu, X. Hypoxia Induced Changes of Exosome Cargo and Subsequent Biological Effects. Front. Immunol. 2022, 13, 824188.
63. Mouillet, J.-F.; Chu, T.; Nelson, D.M.; Mishima, T.; Sadovsky, Y. MiR-205 silences MED1 in hypoxic primary human trophoblasts. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 2010, 24, 2030–2039.
64. Mo, B.; Wu, X.; Wang, X.; Xie, J.; Ye, Z.; Li, L. miR-30e-5p Mitigates Hypoxia-Induced Apoptosis in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Suppressing Bim. Int. J. Biol. Sci. 2019, 15, 1042–1051.
65. Wang, W.; Sun, G.; Zhang, L.; Shi, L.; Zeng, Y. Circulating microRNAs as novel potential biomarkers for early diagnosis of acute stroke in humans. J. Stroke Cerebrovasc. Dis. Off. J. Natl. Stroke Assoc. 2014, 23, 2607–2613.
66. Xu, J.; Li, Y.; Li, Z.; Shao, W.; Song, J.; Wei, J. Acidic Tumor Microenvironment Promotes Pancreatic Cancer through miR-451a/MEF2D Axis. J. Oncol. 2022, 2022, 3966386.
67. Scrimgeour, N.R.; Wrobel, A.; Pinho, M.J.; Høydal, M.A. microRNA-451a prevents activation of matrix metalloproteinases 2 and 9 in human cardiomyocytes during pathological stress stimulation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2020, 318, C94–C102.
68. Yang, J.; Chen, L.; Yang, J.; Ding, J.; Li, S.; Wu, H.; Zhang, J.; Fan, Z.; Dong, W.; Li, X. MicroRNA-22 targeting CBP protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through anti-apoptosis in rats. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 555–561.
69. Chen, S.; Liu, R.; Wang, H.; Liu, Q. Hypoxia-driven miR-1307-3p promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation and invasion by modulating DAB2 interacting protein. Pathol. Res. Pract. 2022, 237, 154066.
70. Veitch, S.; Njock, M.-S.; Chandy, M.; Siraj, M.A.; Chi, L.; Mak, H.; Yu, K.; Rathnakumar, K.; Perez-Romero, C.A.; Chen, Z.; et al. MiR-30 promotes fatty acid beta-oxidation and endothelial cell dysfunction and is a circulating biomarker of coronary microvascular dysfunction in pre-clinical models of diabetes. Cardiovasc. Diabetol. 2022, 21, 31.
71. Kriegel, A.J.; Baker, M.A.; Liu, Y.; Liu, P.; Cowley, A.W.J.; Liang, M. Endogenous microRNAs in human microvascular endothelial cells regulate mRNAs encoded by hypertension-related genes. Hypertension 2015, 66, 793–799.
72. Burton, G.J.; Yung, H.-W.; Cindrova-Davies, T.; Charnock-Jones, D.S. Placental endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in the pathophysiology of unexplained intrauterine growth restriction and early onset preeclampsia. Placenta 2009, 30 (Suppl. A), S43–S48.
73. Carbonell, T.; Gomes, A. V MicroRNAs in the regulation of cellular redox status and its implications in myocardial ischemia-reperfusion injury. Redox Biol. 2020, 36, 101607.
74. Chen, Q.M.; Maltagliati, A.J. Nrf2 at the heart of oxidative stress and cardiac protection. Physiol. Genom. 2018, 50, 77–97.
75. Muralimanoharan, S.; Kwak, Y.-T.; Mendelson, C.R. Redox-Sensitive Transcription Factor NRF2 Enhances Trophoblast Differentiation via Induction of miR-1246 and Aromatase. Endocrinology 2018, 159, 2022–2033.
76. Xie, S.; Jiang, X.; Qin, R.; Song, S.; Lu, Y.; Wang, L.; Chen, Y.; Lu, D. miR-1307 promotes hepatocarcinogenesis by CALR-OSTC-endoplasmic reticulum protein folding pathway. iScience 2021, 24, 103271.
77. Deharde, D.; Klockenbusch, W.; Schmitz, R.; Brand, M.; Köster, H.A.; de Murcia, K.O. Hydroxychloroquine as a Preventive and Therapeutic Option in Preeclampsia—A Literature Review. Geburtshilfe Frauenheilkd. 2020, 80, 679–685.
78. Burton, G.J.; Sebire, N.J.; Myatt, L.; Tannetta, D.; Wang, Y.-L.; Sadovsky, Y.; Staff, A.C.; Redman, C.W. Optimising sample collection for placental research. Placenta 2014, 35, 9–22.
79. Langmead, B.; Trapnell, C.; Pop, M.; Salzberg, S.L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009, 10, R25.
80. Team, R.D.C. A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Available online: https://www.r-project.org (accessed on 10 March 2021).
81. Love, M.I.; Huber, W.; Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014, 15, 550. [Google Scholar] [CrossRef]
82. Team, R.S. RStudio: Integrated Development for R. RStudio. Available online: http://www.rstudio.com/ (accessed on 23 March 2021).