Візуалізація метаболічного перепрограмування метаболічної мережі синтезу жирних кислот відкриває нові діагностичні та терапевтичні можливості для лікування раку молочної залози

Резюме

Передумови

Перепрограмована метаболічна мережа є ключовою ознакою раку. Профілювання метаболічних змін раку за допомогою просторових сигнатур не тільки дає ключі до розуміння біохімічної гетерогенності раку, але й допомагає розшифрувати можливу роль метаболічного перепрограмування в розвитку раку.

Методи

Для характеристики експресії жирних кислот у тканинах раку молочної залози використовували метод мас-спектрометрії із матрично-активованою лазерною десорбцією/іонізацією (МАЛДІ). Специфічне імунофлуоресцентне фарбування було застосовано для дослідження експресії ферментів, пов’язаних із синтезом жирних кислот.

Результати

Було визначено розподіл 23 жирних кислот у тканинах раку молочної залози, і виявилося, що рівень більшості жирних кислот у ракових тканинах значно вищий, ніж у сусідніх нормальних тканинах. Виявлено, що два метаболічні ферменти, синтаза жирних кислот (FASH) та ацетил КоА карбоксилаза (ACC), які беруть участь у синтезі жирних кислот de novo, піддаються надмірній активації при раку молочної залози. Спрямоване зниження активності FASN і ACC є ефективним підходом до обмеження росту, проліферації та метастазування клітин раку молочної залози.

Висновки

Ці дані поглиблюють наше розуміння метаболічного перепрограмування раку і дають уявлення про вивчення метаболічних вразливостей для кращого лікування раку.

Передумови

Рак молочної залози витіснив рак легенів на перше місце серед онкологічних захворювань у світі: у 2020 році було зареєстровано 2,26 мільйона нових випадків захворювання у всьому світі [1]. Він також посідає перше місце серед нових випадків захворювання та смертності від раку у жінок [2]. Важливою особливістю пухлинних клітин є те, що вони можуть перепрограмувати свої метаболічні мережі для підтримки синтезу макромолекул та енергетичних сполук, необхідних для росту, проліферації та метастазування пухлини [3, 4]. Метаболічне перепрограмування раку молочної залози також ретельно вивчалося багатьма дослідниками. Наприклад, ракові клітини молочної залози демонструють типові ознаки ефекту Варбурга. Вони переводять шлях метаболізму глюкози з мітохондріального окисного фосфорилювання на аеробний гліколіз для швидкого вироблення енергії [5, 6]. Метаболічні ферменти, пов’язані з трансмембранним транспортом глюкози та гліколізом, такі як глюкозний транспортер 1 (GLUT1) і гексокіназа 2 (HK2), високо експресуються в клітинах раку молочної залози [7, 8]. У порівнянні з нормальними клітинами, ракові клітини молочної залози зазвичай мають нижчий рівень глюкози і вищий рівень молочної кислоти [9]. Крім того, клітини раку молочної залози також демонструють сильну залежність від глутаміну. З’являється все більше доказів того, що глутаміназа (GLS), ключовий фермент, який регулює метаболізм глутаміну, збільшує свою ативність в клітинах раку молочної залози, що призводить до надмірного використання глутаміну в ракових клітинах молочної залози [10, 11]. У попередніх дослідженнях ми виявили, що карнітин та опосередкований карнітиновою системою шлях β-окислення жирних кислот значно перепрограмовані в ракових тканинах молочної залози [12]. L-карнітин, коротколанцюгові ацилкарнітини та три карнітин-опосередковані ферменти: карнітинпальмітоілтрансфераза 1 А (CPT1A), карнітинпальмітоілтрансфераза 2 (CPT2) та карнітинацетилтрансфераза (CRAT) були більш активними в тканинах раку молочної залози.

Жирні кислоти є важливими будівельними блоками клітинних фосфоліпідів та гліколіпідів. Синтез жирних кислот de novo є незамінним метаболічним шляхом, який перетворює поживні речовини на метаболічні проміжні продукти для формування клітинних мембран, енергетичного обміну та передачі сигналів [13, 14]. Нові дослідження вказують на те, що зміна шляху синтезу жирних кислот тісно пов’язана з виникненням, розвитком і метастазуванням раку молочної залози [15,16,17,18,19]. Park та співавт. виявили, що рівень докозагексаєнової кислоти в крові хворих на рак молочної залози був значно нижчим, ніж у здорових осіб, і що докозагексаєнову кислоту можна використовувати як потенційний діагностичний маркер раку молочної залози [20]. Xu та співавт. показали, що синтаза жирних кислот може сприяти міграції клітин раку молочної залози, регулюючи зміни в метаболізмі жирних кислот [18]. Також повідомлялося, що рівень поліненасичених n-3 жирних кислот у жировій тканині молочної залози тісно пов’язаний з мультифокальністю раку молочної залози [21]. Однак слід зазначити, що тканини раку молочної залози дуже гетерогенні, і дуже важливо точно охарактеризувати просторовий розподіл жирних кислот у різних мікрорегіонах ракової тканини. Мас-спектрометрична візуалілізація (МСВ) – це метод без міток, який дозволяє не тільки виявляти вміст метаболітів, але й безпосередньо картографувати просторовий розподіл метаболітів у біологічних тканинах [22, 23]. Матрично-активована лазерна десорбція/іонізація (МАЛДІ) та десорбційна електроспрей іонізація (ДЕСІ)-МСВ в даний час є найбільш поширеними методами МСВ, а максимальна просторова роздільна здатність може досягати 1,4 мкм [24,25,26,27]. Вони показали дуже цінні перспективи застосування для характеристики просторово-часової метаболічної мережі пухлин, діагностики виникнення раку та з’ясування терапевтичної дії протипухлинних препаратів [28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38].

Метою цього дослідження є візуалізація просторових змін жирних кислот та шляхів їх синтезу в гетерогенних тканинах раку молочної залози, а також виявлення потенційних метаболічних порушень, які можуть бути використані для терапії раку. Поєднуючи просторово-розширений МАЛДІ-МСВ та метод імунофлуоресценції, ми виявили, що експресія жирних кислот і пов’язаних з їх синтезом ферментів – синтази жирних кислот (FASN) та ацетил КоА-карбоксилази (ACC) – у тканинах раку молочної залози значно вища, ніж у прилеглих нормальних тканинах. Багатовимірна статистична класифікаційна модель, побудована на основі просторової експресії жирних кислот, може точно ідентифікувати тканини раку молочної залози та прилеглі нормальні тканини. Крім того, ми виявили, що цілеспрямоване пригнічення активності FASN та ACC є ефективним підходом для обмеження росту, проліферації та метастазування клітин раку молочної залози. Вивчення просторових ознак і змін жирних кислот та їхнього синтетичного шляху de novo в гетерогенних ракових тканинах може дати важливе розуміння того, як можна цілеспрямовано впливати на метаболізм жирних кислот.

Методи

Збір зразків тканин раку молочної залози людини

Всі експерименти були схвалені Інституційною радою з етичної експертизи Шаньдунського онкологічного госпіталю та інституту (№ 201,907,005). 60 зразків тканин раку молочної залози були отримані шляхом хірургічного втручання. Післяопераційні зразки тканини раку молочної залози включають ракові ділянки та прилеглі нормальні ділянки. Перед проведенням експериментів МАЛДІ-МСВ всі зібрані зразки тканин зберігали в холодильнику при температурі -80 °C.

Обробка зразків тканин

П’ять наборів суміжних заморожених зрізів тканини товщиною 10 мкм готували при -25 °C за допомогою кріостата NX50 NOVPD (Thermo Fisher Scientific). Один із зрізів тканини використовували для гістологічного дослідження. Інші два зрізи використовували для аналізу МАЛДІ-МСВ. Останні два зрізи використовували для імунофлуоресцентного фарбування. Зрізи тканин для гістологічного та імунофлуоресцентного забарвлення були розморожені на предметних скельцях мікроскопа Superfrost™ plus. Зрізи тканин, що використовуються для аналізу МАЛДІ-МСВ, необхідно розморозити на предметних скельцях, покритих оксидом індію та олова.

Покриття матриці та аналіз МАЛДІ-МСВ

Перед розпиленням матриці зрізи тканин на предметних скельцях висушували у вакуумі протягом 15 хвилин. Для виявлення більшої кількості жирних кислот ми порівняли результати МАЛДІ-МСВ жирних кислот з 9-AA, 1,5-DAN та BNDM в якості матриці відповідно. Вісім проходів 9-АА (10,0 мг/мл), вісім проходів 1,5-ДАН (2,0 мг/мл) і дванадцять проходів BNDM (1,0 мг/мл) були розпилені на три прилягаючі ділянки тканини за допомогою розпилювача HTX TM-Sprayer™. Швидкість потоку матричного розчину, температура сопла і тиск розпилення були встановлені на 0,075 мл/хв, 55 °C і 10 фунтів на квадратний дюйм, по черзі. Відстань між доріжками становила 3 мм, а швидкість руху доріжок – 80 см/хв. Після розпилення матриці ми використовували мас-спектрометр MALDI tissuetyper™ TOF/TOF (Bruker Daltonics) для проведення експериментів МАЛДІ-МСВ. Мас-спектри були зібрані в діапазоні m/z 80 ~ 1000 в режимі негативних іонів. Просторова роздільна здатність становила 100 мкм. 3D лазер Smartbeam™ випромінював з частотою 5000 Гц.

Імуногістохімія

Для дослідження просторової експресії FASN та ACC у зрізах тканини раку молочної залози два набори зрізів тканини піддавали імунофлуоресцентному аналізу. Після фіксації в 4% розчині параформальдегіду протягом 15 хвилин зрізи тканини раку молочної залози інкубували з 1% бичачим сироватковим альбуміном (BSA) протягом 30 хвилин. Потім ці зрізи тканини інкубували з антитілами FASN (Abcam Cat# ab128870, RRID: AB_11143436, 1:200) та антитілами ACC (Abcam Cat# ab109368, RRID: AB_10864809, 1:100) протягом ночі в інкубаторі при 4 °C. Потім зріз тканини інкубували з вторинним антитілом протягом 50 хвилин, після чого ядро забарвлювали DAPI. До зрізів тканини додавали AutoFluo Quencher ще на 5 хвилин. Нарешті, зрізи поміщали під сканер (3DHISTECH) для отримання зображень.

Клітинна культура та лікування

Клітинну лінію раку молочної залози людини MDA-MB-231 було отримано з Банку клітин Шанхайського інституту біохімії та клітинної біології (Китайська академія наук). Клітини культивували в середовищі Ігла в модифікації Дульбекко (DMEM) (KeyGen Biotech) з додаванням 10% фетальної сироватки великої рогатої худоби (FBS) (Gibco) і 100 ОД/мл антибіотиків (пеніциліну і стрептоміцину) при 37 °C у зволоженому інкубаторі з 5% CO2. Коли злиття клітин досягало 80-90%, додавали TVB-2640 (Selleck, S9714) та/або PF-05175157 (Selleck, S6672) відповідно. Через 24 години життєздатність клітин визначали за допомогою тесту CCK-8 та тесту на утворення колоній, проліферацію клітин відображали за допомогою забарвлення EdU та ядерного забарвлення DAPI, а міграцію клітин контролювали за допомогою аналізу загоєння ран.

Аналіз даних

Зображення МАЛДІ-МСВ були побудовані та оброблені за допомогою програмного забезпечення SCiLS Lab 2018b (SCiLS GmbH). Регіональні профілі жирних кислот були отримані в SCiLS Lab. Аналіз головних компонент, ортогональний дискримінаційний аналіз за методом найменших квадратів, частковий дискримінаційний аналіз за методом найменших квадратів та статистичне прогнозування виконували за допомогою програмного пакету SIMCA-P (версія 14.0, Umetrics AB). Аналіз кривих робочих характеристик приймача і t-тест проводили в програмному забезпеченні GraphPad Prism (версія 6.0). Імунофлуоресцентні зображення обробляли за допомогою програми CaseViewer (3D Histech).

Результати

Розробка методу мас-спектрометричної візуалізації з високим покриттям для картування просторового розподілу жирних кислот у ракових тканинах молочної залози

Післяопераційні ракові тканини молочної залози були розрізані на суцільні зрізи, один з яких був використаний для гістологічного забарвлення. Як показано на зобр. 1а, післяопераційний зріз тканини раку молочної залози містить не тільки ракові ділянки, але й нормальні ділянки, прилеглі до ракових. Як важливий компонент клітинної архітектури, жирні кислоти також відіграють вирішальну роль у передачі клітинних сигналів та енергетичному метаболізмі. Картування просторового розподілу жирних кислот у гетерогенних тканинах раку молочної залози є важливим для нашого розуміння біосинтезу та метаболізму жирних кислот.

МАЛДІ-МСВ пропонує інсайдерський підхід до візуалізації просторового розподілу метаболітів у гетерогенних біологічних тканинах. Однак, вибір матриці МАЛДІ є ключовим фактором для візуалізації метаболітів. Враховуючи, що жирні кислоти містять у своїй структурі карбоксильну групу, аналіз МАЛДІ-МСВ доцільніше проводити в режимі детектування негативних іонів. 9-Аміноакридин (9-АА) і 1,5-діамінонафталін (1, 5-DAN) – дві широко використовувані матриці МАЛДІ в режимі негативних іонів. 1,1′-Бінафтил-2,2′-діамін (BNDM) – двополярна матриця, розроблена нашою групою, яка може полегшити виявлення 301 негативних і 175 позитивних іонів метаболітів у біологічних тканинах [39]. У цій роботі ми порівняли ефективність мас-спектрометричного зображення жирних кислот у зрізах тканин раку молочної залози з використанням 9-АА, 1, 5-DAN та BNDM як матриць відповідно (зобр. 1b). МС-зображення репрезентативних жирних кислот (ЖК), таких як ЖК-16:1 ([M-H]-, m/z 253,2), ЖК-18:1 ([M-H]-, m/z 281,2), ЖК-20:4 ([M-H]-, m/z 303. 2), ЖК-20:3 ([M-H]-, m/z 305.2), ЖК-22:6 ([M-H]-, m/z 327.2) та ЖК-22:5 ([M-H]-, m/z 329.2) у зрізах тканини раку молочної залози проілюстровано на зобр. 1c – зобр. 1h. Коли 9-АА використовували як матрицю МАЛДІ, ЖК демонстрували дуже слабкі сигнали МС. Хоча багато ЖК можна було виявити і візуалізувати, використовуючи 1, 5-DAN в якості матриці МАЛДІ, МС-сигнал ЖК значно посилювався, коли в якості матриці використовували BNDM. З огляду на це, ми обрали BNDM як матрицю для МАЛДІ-МСВ ЖК в тканинах раку молочної залози. При використанні BNDM в якості матриці МАЛДІ було виявлено 23 ЖК, в тому числі одну ЖК C14 (ЖК -14:1), три ЖК C16 (ЖК -16:0, ЖК-16:1, ЖК -16:2), чотири ЖК C18 (ЖК-18:0, ЖК-18:1, ЖК -18:2, ЖК -18:3), шість ЖК C20 (ЖК -20:0, ЖК-20: 1, ЖК-20.2, ЖК-20.3, ЖК-20.4, ЖК-20.5), сім С22 ЖК(FA-22.0, ЖК-22.1, ЖК-22.2, ЖК-22.3, ЖК-22.4, ЖК-22.5, ЖК-22.6) та дві С24 ЖК(ЖК-24.0, ЖК-24.1). Наскільки нам відомо, саме цей метод мас-спектрометричної візуалізації виявляє найбільшу кількість ЖК в біологічних тканинах.

Зображення 1. H&E – Гематоксилін та еозин; Adjacent sections – суміжні зрізи
(а) Гістологічне забарвлення та оптичне зображення зрізу тканини раку молочної залози. (b) Розпилення 9-АА, 1, 5-DAN та BNDM на суміжні зрізи тканини раку молочної залози. (c-h) МС-зображення репрезентативних жирних кислот (ЖК) у зрізах тканини раку молочної залози з використанням 9-АА, 1, 5-DAN та BNDM в якості матриць МАЛДІ

Експресія ЖК значно підвищена в тканинах раку молочної залози

Використовуючи метод МАЛДІ-МСВ з високим покриттям, ми проаналізували експресію ЖК в післяопераційних тканинах 60 пацієнток з раком молочної залози. Більшість післяопераційних зразків містять як ракові, так і нормальні тканини. На зображенні 2а показані типові зображення забарвлення двох тканин раку молочної залози, і межа між раковими і нормальними ділянками може бути точно розмежована. Після проведення МАЛДІ-МСВ аналізу ми виділили 246 мас-спектрів ракових ділянок і 207 мас-спектрів нормальних ділянок з 60 зразків тканин раку молочної залози на основі гістологічного зображення. Результати показали, що експресія більшості жирних кислот в області раку була значно вищою, ніж в парній нормальній області. На зобр. 2b – зобр. 2h показано МС-зображення та статистичні результати семи найбільш регульованих жирних кислот в області раку молочної залози. Рівні ЖК-20:3 і ЖК-16:1 в ділянці раку молочної залози зросли майже в 7 разів порівняно з нормальною ділянкою (зобр. 2d і e). Вміст ЖК-20:2 та ЖК-20:1 збільшився в 5,85 разів та 5,67 разів у зоні раку окремо (зобр. 2с та е). Збільшення вмісту ЖК-18:1, ЖК-22:4 і ЖК-14:0 також досягло 4,18, 3,71 і 3,63 рази, окремо (зобр. 2b, h і g).

Крім того, для вивчення ефективності виявлення ЖК у розрізненні раку молочної залози та нормальних ділянок використовували аналіз кривих операційної характеристики приймача (ROC) для вивчення корисності ЖК у розрізненні раку молочної залози та нормальних ділянок. Ефективність ROC-кривої оцінювали за площею під кривою (ППК). ROC-криві, побудовані на основі ЖК-18:1, ЖК-20:2, ЖК-20:3, ЖК-16:1, ЖК-20:1, ЖК-14:0 і ЖК-22:4, показали хорошу дискримінаційну здатність зі значеннями ППК 0,984, 0,982, 0,967, 0,951, 0,928, 0,943 і 0,918 відповідно (зобр. 2b – зобр. 2h). Ці результати вказують на те, що вміст вищезазначених семи ЖК має високу діагностичну цінність для діагностики раку молочної залози.

Зображення 2. (a) Гістограми двох репрезентативних зрізів тканин раку молочної залози, забарвлених за допомогою H&E. (b-h) МС-зображення, статистичні результати та ROC-криві семи репрезентативних жирних кислот у тканинах раку молочної залози (nnormal, 207; ncancer, 246). Масштаб осі y – log 2; ***, p < 0,001

Молекулярна ідентифікація та діагностика тканини раку молочної залози на основі експресії ЖК

Для подальшого вивчення потенційної цінності жирних кислот у виявленні та діагностиці раку молочної залози ми провели багатовимірний статистичний аналіз на основі профілів жирних кислот 246 ділянок уражених раком молочної залози та 207 прилеглих нормальних ділянок. Для дослідження глобальної тенденції кластеризації та групування раку молочної залози та прилеглих здорових ділянок вперше було проведено неконтрольований аналіз головних компонент (АГК). Хоча існувало деяке перекриття між раком молочної залози і прилеглими нормальними ділянками, тенденція до групування в ракових і нормальних ділянках була дуже очевидною. Крім того, ми провели контрольований ортогональний частковий дискримінаційний аналіз найменших квадратів (ОЧНК-ДА), який може повністю відобразити відмінності між раковими і нормальними ділянками шляхом додавання штучної інформації про групування. На зображенні 3а показано модель ОЧНК-ДА, побудовану на основі даних МАЛДІ-МСВ 23 ЖК. Модель продемонструвала дуже хороші групувальні характеристики, з Q2 значенням 0,824 для одного прогностичного і трьох ортогональних [1 + 3] компонентів, R2 (X) значенням 0,814 і R2 (Y) значенням 0,83. Потім ми провели тест на випадкову перестановку з частковим дискримінаційним аналізом найменших квадратів (ЧНК-ДА), щоб оцінити валідність цієї моделі ОЧНК-ДА. Модель тесту на перестановку була отримана з перехопленнями Q2 = -0,126 і R2 = 0,01, що вказує на те, що ОЧНК-ДА не перенастроюється (зобр. 3b).

Зображення 3. (a) Графіки оцінки ОЧНК-ДА  на основі даних МАЛДІ-МСА для 23 жирних кислот у ракових тканинах молочної залози та парних нормальних тканинах (нормальні, 207; ракові, 246). (b) Графіки валідації ЧНК, отримані на основі 100 тестів перестановок

Далі ми побудували класифікаційну модель ОЧНК-ДА для визначення категорії зразків на основі експресії ЖК. 246 мас-спектрів тканин уражених раком та 207 мас-спектрів нормальних тканин були випадковим чином розділені на дві партії. Перша група включала 123 мас-спектри тканин уражених раком та 103 мас-спектри нормальних тканин, а друга група містила 123 мас-спектри тканин уражених раком та 104 мас-спектри нормальних тканин. Дані з першої групи були використані для побудови моделі ОЧНК-ДА. Як показано на зобр. 4а, модель ОЧНК-ДА показала хорошу тенденцію до кластеризації та групування зі значенням Q2 0,85, R2 (X) 0,773 і R2 (Y) 0,866. Потім зразки з другої партії були взяті як невідомі зразки і введені в модель ОЧНК-ДА для виконання класифікаційного аналізу (зобр. 4b). На зобр. 4c – зобр. 4e проілюстровано прогнозовані результати на другій групі препаратів. Загалом дві пухлинні ділянки були помилково ідентифіковані як нормальні ділянки (стрілки на зобр. 4c), а два нормальні зразки були помилково оцінені як зразки раку (стрілки на зобр. 4d). Загальна точність класифікації для всіх цих 227 випадків зразків (123 ракових зразків і 104 нормальних зразків) досягла 98,2% (зобр. 4e).

Зображення 4. Статистичне прогнозування раку молочної залози на основі класифікаційної моделі ОЧНК-ДА. (a) Графіки оцінки ОЧНК-ДА на основі даних МАЛДІ-МСВ 23 жирних кислот у тканинах раку молочної залози та нормальних тканинах партії (1) (b) Профілі МАЛДІ-МС 23 жирних кислот у тканинах раку молочної залози та нормальних тканинах групи (2) (c) Прогнозовані результати тканин раку молочної залози з групи 2. (d) Прогнозовані результати нормальних тканин молочної залози з групи 2. (e) Матриця плутанини моделі ОЧНК-ДА, що показує результати класифікації тканин раку молочної залози з групи 2.

Візуалізація та кореляція просторових особливостей жирних кислот і метаболічних ферментів, пов’язаних із синтезом жирних кислот, у тканинах раку молочної залози

У цьому дослідженні ми виявили, що експресія більшості жирних кислот у тканинах раку молочної залози була значно вищою, ніж у сусідніх нормальних тканинах. Як правило, ракові клітини намагаються покращити біосинтез ендогенних метаболітів, щоб задовольнити свою нескінченну проліферацію. З точки зору біосинтезу, синтез жирних кислот de novo вимагає двох основних етапів (зобр. 5а): (i) АСС каталізує утворення малоніл-КоА з ацетил-КоА; (ii) після 7 циклів праймінгу, завантаження, конденсації, відновлення, дегідратації, відновлення і гідролізу одна молекула ацетил-КоА і сім молекул малоніл-КоА безперервно конденсуються в пальмітинову кислоту під каталізом FASN. Пальмітинова кислота (ПМА, ЖК-16:0) є першою жирною кислотою, синтезованою de novo, і вона може продовжувати денатуруватися і елонгуватися в декілька типів жирних кислот з різним ступенем насиченості і довжиною.

Пальмітинова кислота показала набагато вищу інтенсивність іонів в ураженій ділянці, ніж у сусідній нормальній ділянці в зрізах тканини раку молочної залози (зобр. 5b і c). ACC і FASN є двома ферментами, що обмежують швидкість синтезу пальмітинової кислоти. Ми припустили, що посилення регуляції синтезу пальмітинової кислоти та інших жирних кислот в тканинах раку молочної залози спричинене аномальною експресією ACC та FASN. Тому ми проаналізували просторову експресію ACC та FASN у тканинах раку молочної залози. Для зіставлення просторових характеристик жирних кислот і пов’язаних з ними метаболічних ферментів ми провели імунофлуоресцентний (ІФ) аналіз на сусідніх ділянках тканин. На зображеннях 5d і e проілюстровано ІФ-зображення ACC і FASN у прилеглих ділянках тканини раку молочної залози. Важливо, що ACC і FASN демонстрували сильнішу експресію в області раку, ніж у прилеглій нормальній області, що добре узгоджується з просторовими характеристиками пальмітинової кислоти.

Зображення 5. (а) Шлях біосинтезу жирних кислот. ( b) Гістограма зрізу тканини раку молочної залози, забарвлена за допомогою H&E. ( c) МС зображення ПМК у зрізі тканини раку молочної залози. (d-e) Імунофлуоресцентні зображення АСС і FASN у зрізі тканини раку молочної залози, АСС і FASN – червоне забарвлення, синє – забарвлення DAPI. АСС – ацетил-КоА карбоксилаза; FASN – синтаза жирних кислот; ПМК – пальмітинова кислота

Дослідження біологічних функцій ACC та FASN у проліферації та метастазуванні ракових клітин молочної залози

За допомогою просторового МАЛДІ-МСІ та ІФ аналізу ми виявили, що жирні кислоти та метаболічні ферменти, пов’язані з синтезом жирних кислот, посилено регулюються в ділянках раку молочної залози. Далі ми дослідили роль ACC і FASN, двох ключових ферментів у шляху синтезу жирних кислот, у проліферації та метастазуванні клітин раку молочної залози.

Попередні дослідження показали, що TVB-2640 і PF-05175157 можуть пригнічувати експресію FASN і ACC в пухлинних клітинах відповідно. У цьому дослідженні TVB-2640 і PF-05175157 використовували для лікування потрійного негативного раку молочної залози людини MDA-MB-231. Щоб дослідити токсичні ефекти TVB-2640 та PF-05175157, ми встановили різні концентрації двох інгібіторів для обробки клітин MDA-MB-231. IC50 TVB-2640 та PF-05175157 до клітин MDA-MB-231 через 24 год становила 131,8 мкМ та 428,5 мкМ відповідно. TVB-2640 і PF-05175157 пригнічували активність клітин тричі негативного раку молочної залози в концентраційно залежний спосіб (зобр. 6а). Для подальшого спостереження за впливом двох інгібіторів на клітини MDA-MB-231 ці клітини були розділені на чотири групи, що включали DMSO, TVB-2640 (100 мкМ), PF-05175157 (300 мкМ) і комбіновану групу. Експеримент з CCK8 показав, що активність клітин комбінованої групи була значно нижчою, ніж у групах з одним інгібітором (зобр. 6b). Експеримент з утворенням клонів показав, що кількість клітинних колоній у групах з одним інгібітором була значно нижчою, ніж у контрольній групі, а кількість клітинних колоній у комбінованій групі була ще нижчою порівняно з групами з одним інгібітором (зобр. 6с). 5-Етиніл-2′-дезоксиуридин (EdU) може замінювати тимідин у синтезі ДНК. EdU-488 може відображати проліферацію клітин, виявляючи синтез ДНК. Наші результати показали, що TVB-2640 і PF-05175157 можуть інгібувати синтез ДНК у клітинах раку молочної залози порівняно з контрольною групою, причому ефект комбінованої групи був значно кращим, ніж групи з одним інгібітором (зобр. 6d). Крім того, вплив TVB-2640 та PF-05175157 на клітини MDA-MB-231 було проаналізовано шляхом дослідження клітинного ядра за допомогою фарбування DAPI. Результати показали, що лікування інгібіторами FASN та ACC може спричинити пікноз та фрагментацію ядра (зобр. 6e). Через 24 год інгібітори FASN та ACC ефективно пригнічували міграцію клітин (зобр. 6f). Наведені вище результати свідчать про те, що TVB-2640 та PF-05175157 можуть пригнічувати проліферацію та метастазування клітин MDA-MB231 потрійного негативного раку молочної залози в залежності від концентрації.

Зображення 6. Вплив інгібіторів ACC та FASN на клітини MDA-MB-231. (a-b) Життєздатність клітин визначали за допомогою тесту CCK-8. (с) Утворення колоній оцінювали за допомогою тесту на колонієутворення. (d) EdU-488 виявляє синтез ДНК у клітинах MDA-MB-231. (e) Забарвлення DAPI відображає зміни в ядрі. (f) Міграцію клітин ПНРМЗ кількісно оцінювали за загоєнням ран.

Обговорення

Метаболічне перепрограмування було визначено візитівкою раку. В останні роки метаболічне перепрограмування жирних кислот в пухлинах привертає все більше уваги. Деякі дослідники використовували технологію МСВ для характеристики просторового розподілу жирних кислот у високогетерогенних раках молочної залози, але при цьому виявляли та візуалізували лише жирні кислоти з високим вмістом, такі як ЖК-18:1, ЖК-20:4, ЖК-22:4 та ін. [27, 40]. У цьому дослідженні, використовуючи BNDM як матрицю МАЛДІ, ми отримали МС-зображення 23 жирних кислот у тканинах раку молочної залози. Просторовий розподіл однієї С14 ЖК (ЖК-14:1), трьох С16 ЖК (ЖК-16:0, ЖК-16:1, ЖК-16:2), чотирьох С18 ЖК (ЖК-18:0, ЖК-18:1, ЖК-18:2, ЖК-18:3), шести С20 ЖК (ЖК-20:0, ЖК-20: 1, ЖК-20.2, ЖК-20.3, ЖК-20.4, ЖК-20.5), сім C22 (ЖК-22.0, ЖК-22.1, ЖК-22.2, ЖК-22.3, ЖК-22.4, ЖК-22.5, ЖК-22.6) та два C24 (ЖК-24.0, ЖК-24.1). Наскільки нам відомо, саме цей метод МСВ виявляє найбільшу кількість жирних кислот у біологічних тканинах.

Виявлено, що просторова експресія більшості жирних кислот у ділянках раку молочної залози значно вища, ніж у парних нормальних ділянках. Виділивши специфічні для регіону МС-профілі жирних кислот у ділянках раку молочної залози та парних нормальних ділянках, ми створили гістологічно достовірну референс-бібліотеку жирних кислот. У поєднанні з багатовимірним статистичним аналізом ми створили класифікаційну модель ОЧНК-ДА, яка може відрізнити ракові тканини молочної залози від нормальних тканин на основі експресії жирних кислот. Без складного фарбування тканин і професійних патологоанатомів ми можемо швидко визначити тип тканини, імпортуючи профілі МС жирних кислот невідомих зразків у режим класифікації ОЧНК-ДА. Ця модель продемонструвала хороші результати в ідентифікації раку молочної залози і нормальних ділянок із загальною точністю 98,2%, забезпечуючи новий підхід до швидкої діагностики раку молочної залози.

Підвищення рівня жирних кислот у ракових тканинах молочної залози може бути пов’язане з їхнім метаболічним перепрограмуванням для підтримки швидкої проліферації та енергетичного обміну. У процесі біосинтезу жирних кислот спочатку виробляється пальмітинова кислота (ЖК-16:0), яка потім денатурується і елонгується в декілька інших типів жирних кислот. ACC і FASN – це два ферменти, що обмежують швидкість біосинтезу пальмітинової кислоти de novo. У цьому дослідженні за допомогою просторового МАЛДІ-МСВ та імунофлуоресцентного аналізу ми виявили, що експресія пальмітинової кислоти, ACC та FASN у тканинах раку молочної залози була значно вищою, ніж у нормальних тканинах. Це свідчить про те, що метаболічне перепрограмування обміну жирних кислот при раку молочної залози відбувається як на рівні метаболічних ферментів, так і на рівні метаболітів. Зіставлення та кореляція характеристик просторової експресії метаболітів та метаболічних ферментів у високогетерогенних ракових тканинах надасть нові знання для з’ясування складного метаболічного перепрограмування ракових клітин.

Спрямований вплив на змінений метаболізм для протипухлинної терапії широко досліджується. Інгібування експресії FASN у ракових клітинах молочної залози може зупинити надмірну активність синтезу жирних кислот. Власне, існує великий інтерес до розробки інгібіторів FASN для обмеження росту ракових клітин [41, 42]. Кілька FASN-специфічних інгібіторів, таких як церуленін [43], C75 [44], орлістат [45] і TVB-2640/3166/3664 [46,47,48], були розроблені для таргетної терапії раку. Таргетування АСС є ще одним підходом до блокування синтезу жирних кислот і обмеження росту ракових клітин [14, 49]. Однак є також повідомлення про те, що інгібування АСС зменшує окислювальний стрес пухлинних клітин і сприяє росту солідних пухлин [50]. У цьому дослідженні ми перевірили вплив інгібіторів FASN та АСС на клітини MDA-MB-231 потрійного негативного раку молочної залози. Препарати TVB-2640 та PF-05175157 є інгібіторами FASN та ACC відповідно і використовуються для лікування клітин раку молочної залози. Результати показують, що і TVB-2640, і PF-05175157 можуть ефективно пригнічувати клітинну активність, проліферацію та метастазування клітин MDA-MB-231. Важливо, що ми також виявили, що при обробці клітин MDA-MB-231 комбінацією TVB-2640 і PF-05175157 ріст, проліферація і здатність до метастазування ракових клітин значно знижуються порівняно з тими, які отримували тільки TVB-2640 або PF-05175157. Це означає, що пригнічення декількох метаболічних мішеней раку шляхом хімічного інгібування може мати кращий ефект для обмеження росту ракових клітин.

Таким чином, ми розробили високочутливий метод МАЛДІ-МСВ для характеристики просторових сигнатур жирних кислот у гетерогенних тканинах раку молочної залози. Загалом було успішно виявлено та візуалізовано 23 жирні кислоти. Більшість жирних кислот демонстрували вищу експресію в ракових ділянках, ніж у парних нормальних ділянках. На основі просторової експресії жирних кислот ми створили класифікаційну модель ОЧНК-ДА для ідентифікації раку молочної залози та нормальних тканин, і загальна точність прогнозування досягла 98,2%. Також було виявлено, що два метаболічні ферменти, ACC і FASN, які беруть участь у синтезі жирних кислот de novo, аномально гіперактивні в тканинах раку молочної залози. Поєднання та кореляція характеристик просторової експресії жирних кислот та ферментів, пов’язаних із синтезом жирних кислот, значно покращить наше розуміння метаболічного перепрограмування раку молочної залози. Крім того, ми підтвердили вирішальну роль FASN і ACC на клітинах MDA-MB-231. Пригнічення експресії FASN та ACC може обмежити ріст, проліферацію та метастазування тричі негативних клітин раку молочної залози, а одночасне пригнічення експресії цих двох ферментів є набагато ефективнішим, ніж пригнічення лише одного з них. Загалом, результати, отримані в цьому дослідженні, вказують на те, що жирні кислоти та ферменти, пов’язані з їхнім синтезом, зазнали значного метаболічного перепрограмування при раку молочної залози, і націлювання на змінений шлях біосинтезу жирних кислот є потенційною стратегією терапії раку молочної залози.

Посилання на джерела

1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A et al. ,. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71:209 – 49
2. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68:394–424.
3. Faubert B, Solmonson A, DeBerardinis RJ. Metabolic reprogramming and cancer progression.Science. 2020;368.
4. Piazza I, Kochanowski K, Cappelletti V, Fuhrer T, Noor E, Sauer U, et al. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of Chemical Communication. Cell. 2018;172:358–72. e23.
5. Sun X, Wang M, Wang M, Yu X, Guo J, Sun T, et al. Metabolic reprogramming in Triple-Negative breast Cancer. Front Oncol. 2020;10:428.
6. Eisenberg L, Eisenberg-Bord M, Eisenberg-Lerner A, Sagi-Eisenberg R. Metabolic alterations in the tumor microenvironment and their role in oncogenesis. Cancer Lett. 2020;484:65–71.
7. Oh S, Kim H, Nam K, Shin I. Glut1 promotes cell proliferation, migration and invasion by regulating epidermal growth factor receptor and integrin signaling in triple-negative breast cancer cells. BMB Rep. 2017;50:132–7.
8. Shen L, O’Shea JM, Kaadige MR, Cunha S, Wilde BR, Cohen AL, et al. Metabolic reprogramming in triple-negative breast cancer through myc suppression of TXNIP. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:5425–30.
9. McCartney A, Vignoli A, Biganzoli L, Love R, Tenori L, Luchinat C, et al. Metabolomics in breast cancer: a decade in review. Cancer Treat Rev. 2018;67:88–96.
10. Masisi BK, El Ansari R, Alfarsi L, Rakha EA, Green AR, Craze ML. The role of glutaminase in cancer. Histopathology. 2020;76:498–508.
11. Cao MD, Lamichhane S, Lundgren S, Bofin A, Fjøsne H, Giskeødegård GF, et al. Metabolic characterization of triple negative breast cancer. BMC Cancer. 2014;14:941.
12. Sun C, Wang F, Zhang Y, Yu J, Wang X. Mass spectrometry imaging-based metabolomics to visualize the spatially resolved reprogramming of carnitine metabolism in breast cancer. Theranostics. 2020;10:7070–82.
13. Madak-Erdogan Z, Band S, Zhao YC, Smith BP, Kulkoyluoglu-Cotul E, Zuo Q, et al. Free fatty acids rewire Cancer metabolism in Obesity-Associated breast Cancer via estrogen receptor and mTOR Signaling. Cancer Res. 2019;79:2494–510.
14. Röhrig F, Schulze A. The multifaceted roles of fatty acid synthesis in cancer. Nat Rev Cancer. 2016;16:732–49.
15. Menendez JA, Lupu R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer. 2007;7:763–77.
16. van Weverwijk A, Koundouros N, Iravani M, Ashenden M, Gao Q, Poulogiannis G, et al. Metabolic adaptability in metastatic breast cancer by AKR1B10-dependent balancing of glycolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun. 2019;10:2698.
17. Gong Y, Ji P, Yang Y-S, Xie S, Yu T-J, Xiao Y, et al. Metabolic-pathway-based subtyping of Triple-Negative breast Cancer reveals potential therapeutic targets. Cell Metabol. 2021;33:51–64e9.
18. Xu S, Chen T, Dong L, Li T, Xue H, Gao B, et al. Fatty acid synthase promotes breast cancer metastasis by mediating changes in fatty acid metabolism. Oncol Lett. 2021;21:27.
19. Camarda R, Zhou AY, Kohnz RA, Balakrishnan S, Mahieu C, Anderton B, et al. Inhibition of fatty acid oxidation as a therapy for MYC-overexpressing triple-negative breast cancer. Nat Med. 2016;22:427–32.
20. Park J, Shin Y, Kim TH, Kim DH, Lee A. Plasma metabolites as possible biomarkers for diagnosis of breast cancer. PLoS ONE. 2019;14:e0225129.
21. Ouldamer L, Goupille C, Vildé A, Arbion F, Body G, Chevalier S, et al. N-3 polyunsaturated fatty acids of Marine Origin and Multifocality in human breast Cancer. PLoS ONE. 2016;11:e0147148.
22. Norris JL, Caprioli RM. Analysis of tissue specimens by Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization imaging Mass Spectrometry in Biological and Clinical Research. Chem Rev. 2013;113:2309–42.
23. Wu C, Dill AL, Eberlin LS, Cooks RG, Ifa DR. Mass spectrometry imaging under ambient conditions. Mass Spectrom Rev. 2013;32:218–43.
24. Kompauer M, Heiles S, Spengler B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 2017;14:90–6.
25. Aichler M, Walch A. MALDI imaging mass spectrometry: current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 2015;95:422–31.
26. Römpp A, Guenther S, Schober Y, Schulz O, Takats Z, Kummer W, et al. Histology by Mass Spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy Bioanalytical Imaging. Angew Chem Int Ed. 2010;49:3834–8.
27. Guenther S, Muirhead LJ, Speller AV, Golf O, Strittmatter N, Ramakrishnan R, et al. Spatially resolved metabolic phenotyping of breast cancer by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Cancer Res. 2015;75:1828–37.
28. Abbassi-Ghadi N, Antonowicz SS, McKenzie JS, Kumar S, Huang J, Jones EA, et al. De Novo Lipogenesis alters the phospholipidome of esophageal adenocarcinoma. Cancer Res. 2020;80:2764–74.
29. Veselkov KA, Mirnezami R, Strittmatter N, Goldin RD, Kinross J, Speller AV, et al. Chemo-informatic strategy for imaging mass spectrometry-based hyperspectral profiling of lipid signatures in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:1216–21.
30. Sun C, Li T, Song X, Huang L, Zang Q, Xu J, et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116:52–7.
31. Zhang J, Li SQ, Lin JQ, Yu W, Eberlin LS. Mass Spectrometry Imaging enables discrimination of Renal Oncocytoma from Renal Cell Cancer Subtypes and normal kidney tissues. Cancer Res. 2020;80:689–98.
32. Randall EC, Lopez BGC, Peng S, Regan MS, Abdelmoula WM, Basu SS, et al. Localized metabolomic gradients in patient-derived xenograft models of Glioblastoma. Cancer Res. 2020;80:1258–67.
33. Banerjee S, Zare RN, Tibshirani RJ, Kunder CA, Nolley R, Fan R, et al. Diagnosis of prostate cancer by desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging of small metabolites and lipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114:3334–9.
34. Calligaris D, Caragacianu D, Liu X, Norton I, Thompson CJ, Richardson AL, et al. Application of desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging in breast cancer margin analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:15184–9.
35. Eberlin LS, Norton I, Orringer D, Dunn IF, Liu X, Ide JL, et al. Ambient mass spectrometry for the intraoperative molecular diagnosis of human brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:1611–6.
36. Santoro AL, Drummond RD, Silva IT, Ferreira SS, Juliano L, Vendramini PH, et al. In situ DESI-MSI lipidomic profiles of breast Cancer Molecular Subtypes and Precursor Lesions. Cancer Res. 2020;80:1246–57.
37. Mascini NE, Eijkel GB, ter Brugge P, Jonkers J, Wesseling J, Heeren RM. The use of mass spectrometry imaging to predict treatment response of patient-derived xenograft models of triple-negative breast cancer. J Proteome Res. 2015;14:1069–75.
38. Mao X, He J, Li T, Lu Z, Sun J, Meng Y, et al. Application of imaging mass spectrometry for the molecular diagnosis of human breast tumors. Sci Rep. 2016;6:21043.
39. Sun C, Liu W, Mu Y, Wang X. 1,1′-binaphthyl-2,2′-diamine as a novel MALDI matrix to enhance the in situ imaging of metabolic heterogeneity in lung cancer. Talanta. 2020;209:120557.
40. Tata A, Woolman M, Ventura M, Bernards N, Ganguly M, Gribble A, et al. Rapid detection of necrosis in breast Cancer with Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Sci Rep. 2016;6:35374.
41. Luengo A, Gui DY, Vander Heiden MG. Targeting metabolism for Cancer Therapy. Cell Chem Biol. 2017;24:1161–80.
42. Martinez-Outschoorn UE, Peiris-Pages M, Pestell RG, Sotgia F, Lisanti MP. Cancer metabolism: a therapeutic perspective. Nat Rev Clin Oncol. 2017;14:11–31.
43. Menendez JA, Vellon L, Mehmi I, Oza BP, Ropero S, Colomer R, et al. Inhibition of fatty acid synthase (FAS) suppresses HER2/neu (erbB-2) oncogene overexpression in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:10715–20.
44. Zhou W, Simpson PJ, McFadden JM, Townsend CA, Medghalchi SM, Vadlamudi A, et al. Fatty acid synthase inhibition triggers apoptosis during S phase in human cancer cells. Cancer Res. 2003;63:7330–7.
45. Kridel SJ, Axelrod F, Rozenkrantz N, Smith JW. Orlistat is a novel inhibitor of fatty acid synthase with antitumor activity. Cancer Res. 2004;64:2070–5.
46. Heuer TS, Ventura R, Mordec K, Lai J, Fridlib M, Buckley D, et al. FASN Inhibition and Taxane Treatment combine to enhance anti-tumor efficacy in Diverse Xenograft Tumor Models through disruption of Tubulin Palmitoylation and Microtubule Organization and FASN inhibition-mediated Effects on Oncogenic Signaling and Gene expression. EBioMedicine. 2017;16:51–62.
47. O’Farrell M, Duke G, Crowley R, Buckley D, Martins EB, Bhattacharya D, et al. FASN inhibition targets multiple drivers of NASH by reducing steatosis, inflammation and fibrosis in preclinical models. Sci Rep. 2022;12:15661.
48. Ventura R, Mordec K, Waszczuk J, Wang Z, Lai J, Fridlib M et al. Inhibition of de novo Palmitate Synthesis by Fatty Acid Synthase Induces Apoptosis in Tumor Cells by Remodeling Cell Membranes, Inhibiting Signaling Pathways, and Reprogramming Gene Expression. EBioMedicine 2015;2:808 – 24.
49. Beckers A, Organe S, Timmermans L, Scheys K, Peeters A, Brusselmans K, et al. Chemical inhibition of acetyl-CoA carboxylase induces growth arrest and cytotoxicity selectively in cancer cells. Cancer Res. 2007;67:8180–7.
50. Jeon S-M, Chandel NS, Hay N. AMPK regulates NADPH homeostasis to promote tumour cell survival during energy stress. Nature. 2012;485:661–5.